Núverandi†Núverandi heimilisfang: OX11 0DE, Bretland, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, Bretland, Diamond Light Source Co., Ltd., Rafræn líffræðileg myndgreiningarmiðstöð.
Ljóssöfnunarfléttan 1 í hvarfmiðstöðinni (RC-LH1) er kjarninn í ljóstillífun fjólublára ljósnæmra baktería. Við kynntum tvær frystingar-rafeindasmásjárbyggingar RC-LH1 fléttunnar úr Rhodopseudomonas palustris. 2,65 Å upplausnarbygging RC-LH114-W fléttunnar samanstendur af 14 undireininga LH1 lykkjum sem umlykja RC, sem er rofin af próteini W, en fléttan án próteins-W er alfarið RC samsetning umkringd RC. Lokuð 16 undireininga LH1 lykkja. Samanburður á þessum byggingum veitir innsýn í gangverki kínóns í RC-LH1 fléttunni, þar á meðal áður óákveðnar byggingarbreytingar þegar kínón bindist við RC QB staðsetninguna, sem og staðsetningu hjálparkínón bindistaðanna, sem hjálpa til við að flytja þá til RC. Einstök uppbygging W próteinsins kemur í veg fyrir lokun LH1 lykkjunnar og býr þannig til rás til að flýta fyrir kínón/kínólón skiptum.
Orkan sem ljóstillífun veitir getur viðhaldið nánast öllu lífi á jörðinni og hún hefur mikla möguleika fyrir sólarlíftækni. Þótt fjólubláar ljóstillífandi bakteríur ýti undir alþjóðlega ljóstillífun sýna þær einnig ýmsa orkugjafa og efnaskiptahæfileika. Þær geta forðast ljóstillífun og vaxið sem ófrumkvöðlar bakteríur í myrkri, geta bundið köfnunarefni og koltvísýring, framleitt vetni og brotið niður arómatísk efnasambönd (1-3). Til að veita orku fyrir þessi ferli verður ljós að breytast fljótt og skilvirkt í efnaorku. Þetta ferli hefst þegar ljósfangandi loftnetsfléttan gleypir ljós og flytur föstu orkuna til hvarfstöðvarinnar (RC), og þar með hefst hleðsluaðskilnaður (4-7). Grunneining ljóstillífunar í fjólubláum ljóstillífandi bakteríum er samsett úr RC af gerð 2, umkringd ljóssöfnunarfléttu 1 (LH1), sem myndar RC-LH1 kjarnafléttuna. LH1 er mynduð af röð af sveigðum αβ tvíliðum, sem hver um sig bindur tvær bakteríublaðgrænu (BChl) a sameindir og eitt eða tvö karótenóíð (8-12). Einfaldasta LH1 loftnetið samanstendur af 16 eða 17 αβ tvíliðum sem umlykja RC (9-13) í lokaðri lykkju, en í öðrum kjarnafléttum trufla himnutengd peptíð samfellu LH1 í kring og stuðla þannig að dreifingu kínóls/kínóns milli RC og cýtókróm bc1 fléttunnar (11, 13-15). Fjólubláa ljósnæma plantan Rhodopseudomonas (Rps.) er fyrirmyndarlífvera sem getur skilið orku- og rafeindaflutninginn sem styður við ljóstillífun. Fyrsta kristalbygging Rps. Fyrirmynd palustris RC-LH1 fléttunnar er RC, umkringd 15 tvíliðum LH1 lykkjum, sem eru rofnar af óþekktu próteini sem kallast „Prótein W“ (14). Prótein-W var síðar greint sem RPA4402, sem er óþekkt 10,5 kDa prótein með þremur spáðum himnutengdum helixum (TMH) (16). Við leggjum til að endurnefna rpa4402 genið sem umritar prótein W í pufW til að vera í samræmi við nafngiftina sem notuð er fyrir gen sem umrita RC-L, M (pufL, pufM) og LH1α, β (pufA, pufB) undireiningar. Athyglisvert er að prótein-W er aðeins til staðar í um 10% af RC-LH1, sem leiðir í ljós að Rps. palustris framleiðir tvö mismunandi RC-LH1 fléttur. Hér greinum við frá hágæða frost-EM (kryo-EM) uppbyggingu tveggja kjarnaflétta, annars með próteini W og 14 αβ tvíliðum, hins án próteins W og lokaðri 16 tvíliðu LH1 lykkju. Uppbygging okkar táknar mikilvæga breytingu í skilningi á RC-LH1 fléttunni í Rps. palustris, því við höfum greint einsleitan þýði hvers afbrigðis og höfum nægilega upplausn til að úthluta skýrt hverju peptíði og bundnum litarefnum og skyldum lípíðum og kínónum. Samanburður á þessum uppbyggingum sýnir að þrjú TMH prótein-W sem hafa ekki fundist í neinu öðru RC-LH1 fléttu hingað til mynda kínónrás til að flýta fyrir kínón/kínólón skiptum. Fjöldi varðveittra lípíð- og kínónbindistaða hefur verið greindur og við höfum leitt í ljós nýja byggingarbreytingu eftir samsetningu kínóns og RC, sem gæti hentað fyrir ljóskerfi II (PSII) RC hjá súrefnisríkum ljósnæmum lífverum. Niðurstöður okkar veita nýja innsýn í hvarfhraða kínón/kínólón bindingar og skipta í RC-LH1 kjarnafléttu fjólubláu ljósnæmra baktería.
Til að auðvelda ítarlega rannsókn á þeim tveimur fléttum sem finnast í Rps. palustris, einangruðum við hvort RC-LH1 flétta með lífefnafræðilegum aðferðum. Prótein W-skorta fléttan (hér eftir nefnd ΔpufW) var hreinsuð úr stofninum sem skortir pufW genið (16) og aðeins einn RC-LH1 flétta er hægt að framleiða. Prótein W-innihaldandi fléttan er framleidd af stofni. Prótein W þessa stofns er breytt með 10x His merki á C-enda sínum, þannig að prótein W-innihaldandi fléttan getur á áhrifaríkan hátt sameinast flestum prótein W-skortandi fléttunum með því að festa málm. Fléttan er aðskilin á áhrifaríkan hátt (16) með sækniskiljun (IMAC).
Eins og sést á mynd 1 innihalda bæði flétturnar þriggja undireininga RC (RC-L, RC-M og RC-H) umkringdar LH1 loftneti. 2,80-A uppbygging fléttunnar sem skortir prótein-W sýnir 16 αβ tvíliður, sem mynda lokaða LH1 lykkju sem umlykur RC algjörlega, hér eftir nefnt RC-LH116 fléttan. 2,65 Å uppbygging fléttunnar sem inniheldur prótein-W hefur 14-víxlliðu LH1 rofin af prótein-W, hér eftir nefnt RC-LH114-W.
(A og B) Yfirborðsframsetning efnasambandsins. (C og D) Tengd litarefni tjáð í stöngum. (E og F) Flétturnar sem sjást frá yfirborði umfrymisins hafa peptíðin og LH1 undireiningarnar sem eru sýndar í teiknimyndum og eru númeraðar réttsælis frá prótein-W bilinu [í samræmi við Rba númerun. sphaeroides flétta (13)]. Fyrir LH1-α er litur prótein undireiningarinnar gulur; fyrir LH1-β er litur prótein undireiningarinnar blár; fyrir prótein-W er próteinið rautt; fyrir RC-H er það blágrænt; fyrir RC-L er það appelsínugult; fyrir RC-M, magenta. Hjálparþættir eru táknaðir með stöngum, grænt táknar BChl og BPha sameindir, fjólublátt táknar karótenóíða og gult táknar UQ10 sameindir. (G og H) Stækkuð mynd af prótein-W bilinu í samsvarandi svæði RC-LH114-W fléttunnar (G) og RC-LH116 fléttunnar (H). Meðvirkir þættir eru sýndir sem fylling á bilinu, kelað kínón er sýnt með bláu. Bilið milli próteins og W er auðkennt með bláum strikalínu í (G) og litlu götin þar sem kínón/kínólól dreifist á LH116 hringnum eru auðkennd með svörtum strikalínu í (H).
Mynd 1 (A og B) sýnir RC umkringt opnum eða lokuðum röðum af LH1αβ tvíliðum, sem hver um sig bindur tvær BChl og eina karótínóíða (Mynd 1, C og D). Fyrri rannsóknir hafa sýnt að Rps er LH1 fléttan. Í lífmyndunarferli spirulina xanthins innihalda þessar tegundir blandaða stofna af karótínóíðum (17). Hins vegar er spiropyrroxanthin ríkjandi karótínóíðað og þéttleiki þess er fullnægjandi. Þess vegna völdum við að líkja eftir spiroxanthin á öllum LH1 bindistaðunum. Alfa og beta fjölpeptíðin eru stakar TMH með stuttum ytri himnusvæðum (Mynd 1, A, B, E og F). Þó að þéttleiki 17 leifa á C-endanum hafi ekki sést, var alfa fjölpeptíðið klofið frá Met1 í Ala46 í báðum fléttunum. β fjölpeptíðið var minnkað úr Gly4 í Tyr52 í RC-LH116 og úr Ser5 í Tyr52 í RC-LH114-W. Enginn þéttleiki 3 eða 4 N-enda eða 13 C-enda leifanna sást (mynd S1). Massagreining á blönduðu RC-LH1 fléttunni sem búin var til úr villta stofninum sýndi að svæðið sem vantaði var afleiðing af ósamhverfri klofningu þessara peptíða (mynd S1 og S2). N-enda formúlering α-Met1 sást einnig (f). Greiningin sýndi að α-peptíðið samanstendur af leifunum fMet1 til Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, og β-peptíðið samanstendur af leifunum Ser2 til Ala53, sem er í góðu samræmi við lághita rafsegulfræðilega þéttleikakortið.
Samhæfing α-His29 og β-His36 myndar BChl-sameindir andspænis hvor annarri; hver αβ tvíliða safnast saman við nágranna sína og myndar opna lykkju (RC-LH114-W) eða lokaða lykkju (RC-LH116) í kringum RC-spennutengda litarefnaröðina (Mynd 1, C og D). Í samanburði við 877 nm bandið í RC-LH114-W er rauðvik frásogs RC-LH116 við 880 nm 3 nm (Mynd 2A). Hins vegar er hringlaga tvílita litrófið næstum því það sama (Mynd 2B), sem bendir til þess að þótt greinilegur munur sé á opnum og lokuðum lykkjum, þá er staðbundið umhverfi BChl-sameinda mjög svipað. Rauðvik frásogs gæti stafað af minni hitahreyfingu og aukinni stöðugleika á lokaða lykkjunni (18, 19), breytingu á litarefnatengingu af völdum lokaða lykkjunnar (20, 21), eða samsetningu þessara tveggja áhrifa (11).
(A) Útfjólublátt/sýnilegt/nær-innrautt frásogsróf, þar sem tindarnir eru merktir með samsvarandi litarefnum og staðlaðir miðað við BPh tindinn við 775 nm. (B) Hringlaga tvílita frásogsróf staðlað miðað við BChl frásog við 805 nm. (C og D) Valin ΔA litróf úr tímauppleystum frásogsrófum RC-LH114-W fléttunnar (C) og RC-LH116 fléttunnar (D). Til að auðvelda samanburð eru öll litróf staðluð miðað við ∆A af −A við 0,2 ps. (E) Oxunarhraði cýtókróm c2 eftir geislun í návist mismunandi styrkleika af UQ2 (sjá mynd S8 fyrir hrágögn). (F) Í frumum sem ræktaðar voru undir lágum, meðal eða miklum ljósstyrk (10, 30 eða 300μMm-2 s-1, talið í sömu röð), prótein W og RC-L undireiningarnar í hreinsaða fléttunni og hlutfall aðskilinnar himnu. Ákvarðið próteinmagn með SDS-pólýakrýlamíðgelrafdrætti og ónæmisprófi (sjá mynd S9 fyrir hrágögn). Ákvarðið hlutfallið miðað við hreinsað RC-LH114-W fléttuna. Steikíómetrískt hlutfall RC-L og próteins-W í fléttunni er 1:1.
BChl-sameindin í stöðu 1 í afsköpuðu αβ14 lykkju RC-LH114-W (mynd 1, A, C og E) eru 6,8 Å nær RC-frumugjafanum (P) en samsvarandi BChl-sameindir í RC-LH116 (mynd 1, B, D og F, og mynd S3); hins vegar sýna tímabundin frásogshraði þessara tveggja fléttna að fyrir RC-LH114-W og RC-LH116 eru örvunarorkuflutningstímastuðlarnir frá LH1 til RC 40 ± 4 og 44 ± 3 ps (mynd 2, C og D, mynd S4 og tafla S2). Það er heldur enginn marktækur munur á rafeindaflutningi innan RC (mynd S5 og tengdur viðbótartexti). Við grunar að náið samræmi orkuflutningstímans milli LH1 og RC-P sé vegna svipaðrar fjarlægðar, horns og stöðuorku flestra BChl-sameinda í LH1 lykkjunum tveimur. Það virðist sem að könnun á orkumynstri LH1 til að ná lágmarksfjarlægð sé ekki hraðari en bein orkuflutningur frá ófullnægjandi stöðum til RC. Opna LH1 lykkjan í RC-LH114-W getur einnig gengist undir óverulega hitauppstreymi við lágt hitastig til byggingargreiningar, og það er lengri αβ14 hringbygging við stofuhita frá litarefnisfjarlægð βBChls á staðsetningu RC 1.
RC-LH116 fléttan inniheldur 32 BChl og 16 karótínóíð, og heildaruppröðun þess er sú sama og fæst úr Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 stofni (PDB ID 7C9R) (12) og grænþörungum (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Eftir röðun sáust aðeins litlar frávik í stöðum αβ tvíliða, sérstaklega 1-5, 15 og 16 (Mynd S6). Nærvera prótein-W hefur veruleg áhrif á uppbyggingu LH1. Þrjár TMH-sameindir þess eru tengdar með stuttum lykkjum, þar sem N-enda er á holrýmishlið fléttunnar og C-enda er á umfrymishliðinni (Myndir 1A og 3, A til D). Prótein-W er að mestu leyti vatnsfælið (mynd 3B) og TMH2 og TMH3 hafa samskipti við LH1αβ-14 og mynda yfirborð sem liggur yfir himnuna (mynd 3, B og E til G). Tengisvæðið samanstendur aðallega af Phe, Leu og Val leifum í himnusvæðinu. Þessar leifar eru staflaðar með vatnsfælnum amínósýrum og αβ-14 litarefnum. Sumar pólleifar stuðla einnig að víxlverkuninni, þar á meðal vetnistengi milli W-Thr68 og β-Trp42 á yfirborði flókna holrýmisins (mynd 3, F og G). Á yfirborði umfrymisins er Gln34 aðliggjandi ketóhópnum í αβ-14 karótenóíðum. Að auki var n-dódesýl β-d-maltósíð (β-DDM) sameindin aðskilin og vatnsfælinn hali hennar náði að tengisvæðinu milli prótein-W og αβ-14, og lípíðhalinn gæti verið staðsettur í líkamanum. Við tókum einnig eftir því að C-enda upplausnarsvæði próteins W og RCH eru mjög nálægt hvort öðru, en ekki innan svigrúms til að mynda sértækar víxlverkanir (Mynd 1, A og E). Hins vegar gætu verið víxlverkanir í óuppleystum C-enda amínósýrum þessara tveggja próteina, sem gætu veitt aðferð til að safna próteini-W við myndun RC-LH114-W fléttunnar.
(A) Prótein-W, sem snýr að snertifletinum við LH1αβ14 í teiknimyndaformi, hefur stönglaga hliðarkeðju (rauð), sem sýnd er í hluta af rafstöðuorkumyndinni (gagnsætt grátt yfirborð með útlínustigi 0,13). (B) Prótein-W táknað með vatnsfælnu lituðu yfirborði. Pól- og hlaðin svæði eru sýnd í blágrænu, vatnsfælin svæði eru sýnd í hvítu og mjög vatnsfælin svæði eru sýnd í appelsínugulu. (C og D) Prótein-W táknað í teiknimyndinni, stefna þess er sú sama og í (A) (C) og snúið um 180° (D). Samkvæmt staðsetningu í röðinni eru aðgreinanlegu leifarnar regnbogalitir, þar sem N-endi er blár og C-endi er rauður. (E) Prótein-W í sömu sýn og í (A) og leifarnar á snertifleti prótein-W:LH1 eru táknaðar með stöngum með áföstum merkjum. (F) Prótein-W er snúið um 90° miðað við (E) og LH1αβ14 í teiknimyndaframsetningunni og miðað við tengifletisleifarnar í súluframsetningunni. Yfirliggjandi leifar beta-pólýpeptíðsins eru merktar. Meðvirkniþátturinn er sýndur sem súla í sama lit og á mynd 1, niðurbrotið β-DDM er sýnt í gráu og súrefnið er sýnt í rauðu. (G) Myndin í (F) er snúið um 180°, með áberandi leifum merkta alfa-pólýpeptíðsins.
Prótein-W kemur í stað αβ tvíliðu (þann 15. á mynd 1F) og kemur þannig í veg fyrir lokun lykkja og hallar fyrstu þriggja αβ tvíliðanna. Það kom í ljós að hámarkshalla fyrsta αβ-1 tvíliðunnar miðað við filmunormalið var 25° til 29° (mynd 1, A og E), sem myndaðist af 2° til 8° halla αβ-1 í RC A sharp contrast-LH116 (mynd 1, B og F). Önnur og þriðja tvíliðan halla sér um 12° til 22° og 5° til 10°, talið í sömu röð. Vegna sterískrar hindrunar í RC nær halli αβ-1 ekki til annars parsins af αβ (sem samsvarar 16. αβ á mynd 1F) og myndar þannig greinilegt bil í LH1 hringnum (mynd 1, A og E). Vegna skorts á tveimur αβ tvíliðum, ásamt tapi á fjórum BChl og tveimur karótínóíðum, bindst ekkert karótínóíðanna við snúna αβ-1 undireininguna, sem leiðir til LH114-W hrings sem inniheldur 13 grænmetisæta karótínóíða og 28 BChl. Mat á staðbundinni upplausn tveggja fléttanna í svæðunum αβ1 til 7 er lægra en fyrir restina af LH1 lykkjunni, sem gæti endurspeglað meðfædda sveigjanleika LH1 undireiningarinnar sem liggur að RC QB staðnum (Mynd 4).
Myndirnar af RC-LH114-W (A og B) og RC-LH116 (C og D) eru sýndar frá sömu sýn ofan frá/hliðar (A og B) (A og C) og holrýminu eins og sést á mynd 1 (B og D). Lituðu takkarnir eru sýndir til hægri.
Eina önnur einkennandi kjarnaflétta með steikíómetrískt hlutfall upp á 1:14 er Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX tvíliðan (13). Hins vegar hafa prótein W og PufX enga augljósa samsvörun og hafa veruleg áhrif á LH1 uppbyggingu þeirra. PufX er ein TMH með N-enda umfrymisléni sem hefur samskipti við umfrymishlið RC-H undireiningarinnar (13) á staðsetningu sem samsvarar Rps. palustris LH116αβ-16. PufX býr til rás fyrir kínón/kínólón skipti milli RC-LH1 og cýtókróm bcl fléttunnar og er til staðar í öllum Rba. sphaeroides kjarnafléttunni (13). Þó að einliða-einliða tengifleturinn sé í Rba. Sphaeroides RC-LH1-PufX tvíliðan er staðsett á bindingarstöðu próteins W í RC-LH114-W, og bilið sem PufX og prótein-W valda er á samsvarandi stað (Mynd S7A). Bilið í RC-LH114-W er einnig í takt við tilgátulega kínónrás (8) í Pseudomonas rosea LH1, sem myndast af peptíðum sem ekki tengjast próteini W eða PufX (Mynd S7B). Að auki er kínónrásin í Blc. Smaragðgræna LH1, sem myndast við að útiloka eina γ undireiningu (7), er staðsett á svipuðum stað (Mynd S7C). Þótt það sé miðlað af mismunandi próteinum, virðist tilkoma þessara kínón/kínólólrása á sameiginlegri stöðu í RC-LH1 fléttunni vera dæmi um samleitna þróun, sem bendir til þess að bilið sem prótein W skapar gæti virkað sem kínónrás.
Bilið í LH114-W lykkjunni gerir kleift að mynda samfellt himnusvæði milli innra rýmis RC-LH114-W fléttunnar og meginhimnunnar (mynd 1G), frekar en að tengja þessi tvö svæði í gegnum próteingöng eins og í próteinum. RC-LH116 fléttan er svipuð lokuðu Tch. nálarlaga fléttu (22) (mynd 1H). Þar sem dreifing kínóns í gegnum himnuna er hraðari en dreifingin í gegnum þrönga próteingöngin, getur opna LH114-W lykkjan leyft hraðari RC veltu en lokaða LH116 lykkjan, og dreifing kínóns í RC getur verið takmarkaðri. Til að prófa hvort prótein W hafi áhrif á umbreytingu kínóna í gegnum RC, framkvæmdum við cýtókróm oxunarpróf á ákveðnum styrk af úbíkínóni 2 (UQ2) (hliðstæða náttúrulegs UQ10 með styttri ísópren hala) (mynd 2E). Þó að nærvera kelaðs kínóns hindri nákvæma ákvörðun á sýnilegum Michaelis-stuðli (RC-LH114-W og RC-LH116 henta fyrir 0,2 ± 0,1 μM og 0,5 ± 0,2 μM, talið í sömu röð), þá er hámarkshraði RC-LH114-W (4,6 ± 0,2 e-RC-1 s-1) 28 ± 5% hærri en RC-LH116 (3,6 ± 0,1 e-RC-1 s-1).
Við áætluðum upphaflega að prótein-W væri til staðar í um 10% af kjarnafléttunni (16); hér er nýtingarhlutfall frumna í litlu, meðalljósu og miklu ljósi 15±0,6%, 11±1% og 0,9±0,5%, talið í sömu röð (Mynd 2F). Megindleg samanburður á massagreiningu sýndi að viðbót histidínmerkis minnkaði ekki hlutfallslegt magn próteins-W samanborið við villta stofna (P = 0,59), þannig að þessi gildi eru ekki arfleifð breytts próteins-W (Mynd S10). Hins vegar gæti þessi lága nýtingarhlutfall próteins-W í RC-LH1 fléttunni gert sumum RC frumum kleift að snúast við hraðar og þar með draga úr hægari kínón/kínólón skipti í RC-LH116 fléttunni. Við tókum eftir því að nýtingarhlutfallið við mikið ljós er ekki í samræmi við nýleg umritunargögn, sem benda til þess að tjáning pufW gena eykst við sterkt ljós (Mynd S11) (23). Munurinn á umritun pufW og innlimun prótein-W í RC-LH1 fléttuna er ruglingslegur og gæti endurspeglað flókna stjórnun próteinsins.
Í RC-LH114-W eru 6 kardiolipin (CDL), 7 fosfatidýlkólín (POPC), 1 fosfatidýlglýseról (POPG) og 29 β-DDM sameindir úthlutaðar og módeluð í henni: 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG og 12 βDDM. RC-LH116 (Mynd 5, A og B). Í þessum tveimur strúktúrum er CDL næstum staðsett á umfrymishlið fléttunnar, en POPC, POPG og β-DDM eru að mestu leyti staðsett á ljósopshliðinni. Tvær lípíð- og þvottaefnissameindir voru einangraðar í αβ-1 til αβ-6 svæðinu í RC-LH114-W fléttunni (Mynd 5A) og fimm voru einangraðar í samsvarandi svæði RC-LH116 (Mynd 5B). Fleiri lípíð fundust hinum megin við fléttuna, aðallega CDL, sem safnaðist fyrir á milli RC og αβ-7 til αβ-13 (Mynd 5, A og B). Önnur byggingarlega aðgreind lípíð og hreinsiefni eru staðsett utan LH1 hringsins, og vel aðgreindar asýlkeðjur teygja sig á milli LH1 undireininga, sem eru bráðabirgða merktar sem β-DDM í RC-LH114-W, og skilgreindar sem β-DDM í RC A blanda af β-DDM og POPC-LH116. Svipuð staðsetning klóbindandi lípíða og hreinsiefna í uppbyggingu okkar benda til þess að þau séu lífeðlisfræðilega mikilvæg bindistaðir (Mynd S12A). Staðsetningar jafngildra sameinda í Tch hafa einnig góða samræmi. Gentle og Trv. Stofn 970 RC-LH1s (mynd S12, B til E) (9, 12) og vetnistengisleifar lípíðhaushópsins sýndu nokkuð góða varðveislu í röðun raðarinnar (mynd S13), sem bendir til þess að varðveitt CDL sem binst RC (24), þessir staðir gætu verið varðveittir í RC-LH1 fléttunni.
(A og B) RC-LH114-W (A) og RC-LH116 (B) peptíðin eru táknuð með teiknimyndum og litarefnin eru táknuð með stöngum, samkvæmt litasamsetningu myndar 1. Lípíð eru sýnd með rauðu og þvottaefni eru sýnd með gráu. UQ bundið við RC QA og QB stöður er gult, en einangrað UQ er blátt. (C og D) Sömu myndir og (A) og (B), án lípíða. (E til G) Stækkuð mynd af Q1(E), Q2(F) og Q3(G) úr RC-LH116, með hliðarkeðjum sem hafa áhrif hvor á aðra. Vetnistengi eru sýnd sem svört strikalína.
Í RC-LH116 eru bæði RC QA og QB UQ, sem taka þátt í rafeindaflutningi í hleðsluaðskilnaðarferlinu, sundruð í bindistaði sínum. Hins vegar, í RC-LH114-W, hefur QB kínón ekki verið aðgreint og verður það rætt nánar hér að neðan. Auk QA og QB kínóna eru tvær klóbundnar UQ sameindir (staðsettar á milli RC og LH1 hringjanna) úthlutaðar í RC-LH114-W byggingu samkvæmt vel aðgreindum höfuðhópum þeirra (staðsettar í Q1 og Q2, talið í sömu röð). Mynd 5C). Tvær ísópren einingar eru úthlutaðar Q1 og þéttleikakortið leysir upp alla 10 ísópren hala Q2. Í byggingu RC-LH116 voru þrjár klóbundnar UQ10 sameindir (Q1 til Q3, mynd 5D) aðgreindar og allar sameindir hafa greinilega þéttleika um allan halann (mynd 5, D til G). Í þessum tveimur byggingum er staðsetning kínónhaushópanna í Q1 og Q2 mjög samræmi (mynd S12F) og þeir hafa aðeins samskipti við RC. Q1 er staðsett við inngang W bilsins í RC-LH114-W (mynd 1G og 5, C, D og E) og Q2 er staðsett nálægt QB bindistaðnum (mynd 5, C, D) og F). Varðveittu L-Trp143 og L-Trp269 leifarnar eru mjög nálægt Q1 og Q2 og bjóða upp á mögulegar π-staflaðar víxlverkanir (mynd 5, E og F, og mynd S12). L-Gln88, 3,0 Å frá ysta súrefnishluta Q1, myndar sterkt vetnistengi (mynd 5E); þessi leif er varðveitt í öllum RC nema því fjarlægasta (mynd S13). L-Ser91 er íhaldssamt skipt út fyrir Thr í flestum öðrum RC (mynd S13), er 3,8 Angström frá metýlsúrefninu í Q1 og getur myndað veik vetnistengi (mynd 5E). Q3 virðist ekki hafa sértæka víxlverkun en er staðsett í vatnsfælna svæðinu milli RC-M undireiningarinnar og LH1-α undireiningarinnar 5 til 6 (mynd 5, D og G). Q1, Q2 og Q3 eða nálægir klótengdir kínónar hafa einnig verið aðgreindir í Tch. Gentle, Trv. stofni 970 og Blc. Lithimnubyggingin (9, 10, 12) bendir til varðveitts hjálparkínónbindingarstaðar í RC-LH1 fléttunni (mynd S12G). Fimm niðurbrotnu UQ-sameindirnar í RC-LH116 eru í góðu samræmi við 5,8 ± 0,7 fyrir hvert fléttu sem ákvarðað var með háafköstavökvaskiljun (HPLC), en þrjú niðurbrotnu UQ-gildin í RC-LH114-W eru lægri en Mæligildið 6,2 ± 0,3 (Mynd S14) gefur til kynna að það séu óleystar UQ-sameindir í uppbyggingunni.
Sýndar-samhverfu L og M fjölpeptíðin innihalda hvert um sig fimm TMH og mynda tvíliðu sem sameinar eina BChl tvíliðu, tvær BChl einliður, tvær bakteríufága (BPh) einliður og eina járnlausa járnsameindir og eina eða tvær UQ10 sameindir. Vegna vetnistengja á ketónhópnum og þekktrar uppsöfnunar hans í Rps eru karótínóíð tekin upp í M-undireininguna, sem kallast cis-3,4-dehýdróorhodopin. Tegund (25). Ytri himnusvæði RC-H er fest við himnuna með einni TMH. Heildarbygging RC er svipuð og þriggja undireininga RC skyldra tegunda (eins og Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). Makróhringirnir BChl og BPh, karótínóíð hryggurinn og járnlausa járnið skarast innan upplausnarbils þessara bygginga, eins og UQ10 höfuðhópurinn á QA staðnum og QB kínóninn á RC-LH116 (Mynd S15).
Tilvist tveggja RC-bygginga með mismunandi nýtingartíðni QB-staða býður upp á nýtt tækifæri til að skoða þær stöðugu breytingar á byggingarlagi sem fylgja bindingu QB-kínóns. Í RC-LH116 fléttunni er QB-kínón staðsett í fullbundinni „næðri“ stöðu (26), en aðskilnaður RC-LH114-W inniheldur ekki QB-kínón. Það er ekkert QB-kínón í RC-LH114-W, sem kemur á óvart þar sem fléttan er virkur, frekar en RC-LH116 fléttan með byggingarlega aðskildu QB-kínóni. Þó að tveir LH1-hringirnir kela um sex kínón, eru fimm byggingarlega aðskildir í lokaða RC-LH116 hringnum, en aðeins þrír eru byggingarlega takmarkaðir í opna RC-LH114-W hringnum. Þessi aukna byggingarröskun gæti endurspeglað hraðari skiptingu á RC-LH114-W QB-stöðum, hraðari kínónhreyfingar í fléttunni og aukna líkur á að fara yfir LH1-lykkjuna. Við leggjum til að skortur á UQ í RC QB svæðinu í RC-LH114-W gæti verið afleiðing af flóknara og virkara fléttu og að QB svæðinu í RC-LH114-W hafi strax verið fryst í UQ veltunni. Sértæka stigið (inngangurinn að QB svæðinu hefur verið lokaður) endurspeglar byggingarlag þessarar virkni.
Án QB fylgir snúningur L-Phe217 í stöðu sem er ósamrýmanleg UQ10 bindingu, því það veldur rúmfræðilegri árekstur við fyrstu ísópren eininguna í halanum (Mynd 6A). Að auki eru augljósar helstu byggingarbreytingar augljósar, sérstaklega helix de (stuttur helix í lykkjunni milli TMH D og E) þar sem L-Phe217 færist að QB bindingarvasanum og snúningur L-Tyr223 (Mynd 6A) til að rjúfa vetnistengið við M-Asp45 rammann og loka innganginum að QB bindingarstaðnum (Mynd 6B). Helix de snýst við botninn, Cα L-Ser209 færist um 0,33 Å, en L-Val221Cα færist um 3,52 Å. Engar sjáanlegar breytingar eru í TMH D og E, sem eru ofan á hvora byggingu (Mynd 6A). Svo vitað sé er þetta fyrsta uppbyggingin í náttúrulega RC sem lokar QB-stöðunni. Samanburður við heildaruppbygginguna (QB-bundna) sýnir að áður en kínónið er afoxað þarf byggingarbreytingu til að það komist inn í kínónið. L-Phe217 snýst til að mynda π-staflaða víxlverkun við kínónhaushópinn og helixinn færist út á við, sem gerir beinagrind L-Gly222 og hliðarkeðju L-Tyr223 kleift að mynda vetnistengisnet með stöðugri vetnistengisbyggingu (Mynd 6, A og C).
(A) Skerandi teiknimynd af heilmynd (L keðja, appelsínugult/M keðja, magenta) og apó (grátt) uppbyggingu, þar sem lykilleifarnar eru sýndar í formi stönglaga framsetningar. UQ10 er táknað með gulum súlum. Punktalínan gefur til kynna vetnistengi sem myndast í allri uppbyggingunni. (B og C) Yfirborðsframsetning apólípópróteinsins og allrar hringbyggingarinnar, þar sem súrefnisþættir hliðarkeðjunnar í L-Phe217 eru auðkenndir með bláu og L-Tyr223 með rauðu, talið í sömu röð. L undireiningin er appelsínugult; M og H undireiningarnar eru ekki litaðar. (D og E) Apólípóprótein (D) og heil (E) RC QB staðsetningar [litaðar með (A) talið í sömu röð] og Thermophilus thermophilus PSII (grænt, blátt með plastkínóni; PDB ID: 3WU2) Samræma (58).
Óvænt, þó að nokkrar byggingar af QB-skortandi RC án LH1 séu tiltækar, hafa byggingarbreytingarnar sem komu fram í þessari rannsókn ekki verið birtar áður. Þar á meðal eru QB eyðingarbygging frá Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) og Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), sem allar eru næstum eins og heildar QB byggingar þeirra. Nákvæm skoðun á 3PRC leiddi í ljós að LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) þvottaefnissameindir bindast við inngang QB stöðunnar, sem getur komið í veg fyrir endurröðun í lokaða lögun. Þó að LDAO brotni ekki niður á sama stað í 1EYS eða 1OGV, eru þessar RC búnar til með sama þvottaefni og geta því valdið sömu áhrifum. Kristallabygging Rba. Sphaeroides RC, sem er samkristallað með cýtókróm c2 (PDB ID: 1L9B), virðist einnig hafa lokaðan QB-stað. Hins vegar, í þessu tilfelli, tekur N-enda svæðið á RC-M fjölpeptíðinu (sem hefur samskipti við QB-bindistaðinn í gegnum H-tengið á Tyr-leifinni á Q-helixnum) upp óeðlilega byggingu og breytingin á QB-byggingu er ekki könnuð frekar (30). Það sem er hughreystandi er að við höfum ekki séð þessa tegund af aflögun á M fjölpeptíðinu í RC-LH114-W uppbyggingunni, sem er næstum því sú sama og N-enda svæðið á RC-LH116 RC. Einnig skal tekið fram að eftir að LH1-loftnetið, sem byggir á þvottaefni, var útrýmt, voru apólípóprótein RC í PDB aðskilin, sem útrýmdi innri kínónlaugum og lípíðum í bilinu milli RC og innra yfirborðs LH1-hringsins í kring (31, 32). RC er enn virkt vegna þess að það heldur í alla meðvirka þætti, nema niðurbrjótanlega QB kínónið, sem er minna stöðugt og tapast oft við framleiðsluferlið (33). Þar að auki er vitað að fjarlæging LH1 og náttúrulegra hringlaga lípíða úr RC getur haft áhrif á virkni, svo sem styttri líftíma hleðsluaðskilins P+QB-ástands (31, 34, 35). Þess vegna gerum við ráð fyrir að tilvist staðbundins LH1 hrings sem umlykur RC geti viðhaldið „lokaða“ QB-staðnum og þar með varðveitt staðbundið umhverfi nálægt QB.
Þó að apólípóprótein (án QB kínóns) og heildarbyggingin sýni aðeins tvær myndir af endurnýjun QB-staðarins, frekar en röð atburða, eru vísbendingar um að hægt sé að stýra bindingunni til að koma í veg fyrir endurbindingu af völdum hýdrókínóns til að hindra hömlun á hvarfefni. Samspil kínólóls og kínóns nálægt QB-stað apólípópróteins getur verið mismunandi, sem leiðir til höfnunar þess af RC. Lengi hefur verið lagt til að byggingarbreytingar gegni hlutverki í bindingu og afoxun kínóna. Hæfni frystra RC til að afoxa kínóna eftir aðlögun að myrkri er skert (36); Röntgenkristallagreining sýnir að þessi skaði stafar af því að QB kínón eru föst í „fjarlægri“ byggingu um 4,5 Å frá virku nærstöðunni (26, 37). Við leggjum til að þessi fjarlæga bindingarbygging sé mynd af millistigi apólípópróteins og heildarhringbyggingarinnar, sem fylgir upphaflegri víxlverkun við kínón og opnun QB-staðarins.
RC af gerð II sem finnst í PSII flóknu ákveðinna ljósnæmra baktería og blágrænna, þörunga og plantna hefur varðveislu byggingar og virkni (38). Byggingarröðunin sem sýnd er á mynd 6 (D og E) undirstrikar líktina milli PSII RC og QB staðsetningar bakteríu-RC flókunnar. Þessi samanburður hefur lengi verið fyrirmynd til að rannsaka nátengd kerfi kínónbindingar og afoxunar. Fyrri rit bentu til þess að byggingarbreytingar fylgi PSII afoxun kínóna (39, 40). Þess vegna, miðað við þróunarvarðveislu RC, gæti þessi áður óséði bindingaraðferð einnig átt við um QB staðsetningu PSII RC í súrefnisríkum ljósnæmum plöntum.
Rps ΔpufW (ómerkt pufW eyðing) og PufW-His (C-enda 10x His-merkt prótein-W tjáð úr náttúrulegum pufW genasæti) stofnum. palustris CGA009 var lýst í fyrri rannsóknum okkar (16). Þessir stofnar og ísógenísk villta foreldri voru endurheimt úr frysti með því að strjúka litlum fjölda frumna á PYE (hver 5 g lítri -1) (geymt í LB við -80 °C, sem innihélt 50% (w/v) glýseról) prótein, gerþykkni og súksínat) agar [1,5% (w/v)] plötu. Platan var ræktuð yfir nótt í myrkri við stofuhita við loftfirrtar aðstæður og síðan lýst upp með hvítu ljósi (~50 μmolm-2 s-1) frá OSRAM 116-W halógenperum (RS Components, Bretlandi) í 3 til 5 daga þar til ein nýlenda birtist. Ein nýlenda var notuð til að sá 10 ml af M22+ miðli (41) bætt við 0,1% (w/v) kasínósýrum (hér eftir nefnt M22). Ræktunin var ræktuð við lágt súrefnisinnihald í myrkri við 34°C með hristingu við 180 snúninga á mínútu í 48 klukkustundir og síðan voru 70 ml af ræktuninni sáð við sömu aðstæður í 24 klukkustundir. Hálf-loftháð ræktun með 1 ml rúmmáli er notuð til að sá 30 ml af M22 miðli í 30 ml alhliða skrúftappa gegnsæja glerflösku og geisluð með hristingu (~50μmolm-2 s-1) í 48 klukkustundir með dauðhreinsuðum segulkraftshræristöng. Síðan voru 30 ml af ræktuninni sáð með um 1 lítra af ræktun við sömu aðstæður, sem síðan var notað til að sá um 9 lítra af ræktun lýstri við ~200 μmolm-2 s-1 í 72 klukkustundir. Frumurnar voru teknar með skilvindu við 7132 RCF í 30 mínútur, leystar upp aftur í ~10 ml af 20 mM tris-HCl (pH 8,0) og geymdar við -20°C þar til þeirra var þörf.
Eftir þíðingu skal bæta nokkrum kristöllum af deoxýríbónúkleasa I (Merck, Bretlandi), lýsósími (Merck, Bretlandi) og tveimur Roche holóensím próteasahemli töflum (Merck, Bretlandi) við enduruppleystu frumurnar. Í 20.000 psi frönskum þrýstihólfi (Aminco, Bandaríkjunum) voru frumurnar rofnar 8 til 12 sinnum. Eftir að óbrotnar frumur og óleysanleg úrgangur höfðu verið fjarlægður með skilvindu við 18.500 RCF í 15 mínútur við 4°C, var himnan felld út úr litaða lýsatinu með skilvindu við 113.000 RCF í 2 klukkustundir við 43.000°C. Fargið leysanlega hlutanum og enduruppleysið litaða himnuna í 100 til 200 ml af 20 mM tris-HCl (pH 8,0) og blandið saman þar til engar sýnilegar agnir eru eftir. Sviflausnin var ræktuð í 20 mM tris-HCl (pH 8,0) (Anatrace, Bandaríkjunum) sem innihélt 2% (w/v) β-DDM í 1 klukkustund í myrkri við 4°C undir varlegri hræringu. Síðan var skilvindað við 70°C til að leysa upp 150.000 RCF við 4°C í 1 klukkustund til að fjarlægja leifar af óleysanlegum efnum.
Leysihimna úr ΔpufW stofninum var sett á 50 ml DEAE Sepharose jónskiptasúlu með þremur súlurúmmálum (CV) af bindingarlausn [20 mM tris-HCl (pH 8,0) sem innihélt 0,03% (w/v) β-DDM]. Þvoið súluna með tveimur CV bindingarlausnum og síðan með tveimur bindingarlausnum sem innihéldu 50 mM NaCl. RC-LH116 fléttan var skoluð út með línulegum halla frá 150 til 300 mM NaCl (í bindingarlausn) við 1,75 CV og eftirstandandi bindingarfléttan var skoluð út með bindingarlausn sem innihélt 300 mM NaCl við 0,5 CV. Safnið frásogsrófinu á milli 250 og 1000 nm, haldið broti með frásogshlutfalli (A880/A280) stærra en 1 við 880 til 280 nm, þynnið það tvisvar í bindingarlausninni og notið sömu aðferð aftur á DEAE dálknum við hreinsun. Þynnið brotin með A880/A280 hlutföllum hærri en 1,7 og A880/A805 hlutföllum hærri en 3,0, framkvæmið þriðju umferð jónaskipta og haldið brotum með A880/A280 hlutföllum hærri en 2,2 og A880/A805 hlutföllum hærri en 5,0. Hluthreinsaða komplexið var þétt í ~2 ml í Amicon 100.000 mólþyngdarmörkum (MWCO) miðflóttasíu (Merck, Bretlandi) og sett á Superdex 200 16/600 stærðarútilokunarsúlu (GE Healthcare, Bandaríkjunum) sem innihélt 200 mM NaCl stuðpúða og síðan skolað út í sama stuðpúða við 1,5 CV. Safnið frásogsrófum stærðarútilokunarbrotsins og þéttið frásogsrófin með A880/A280 hlutföllum yfir 2,4 og A880/A805 hlutföllum yfir 5,8 til 100 A880 og notið þau strax til að undirbúa eða geyma kryo-TEM rist. Geymið við -80°C þar til þörf krefur.
Leysihimna úr PufW-His stofni var sett á 20 ml HisPrep FF Ni-NTA Sepharose dálk (20 mM tris-HCl (pH 8,0) sem innihélt 200 mM NaCl og 0,03% (w/w)) í IMAC stuðpúða (GE Healthcare). v) β-DDM]. Dálkurinn var þveginn með fimm CV-söfnum af IMAC stuðpúða og síðan með fimm CV-söfnum af IMAC stuðpúða sem innihélt 10 mM histidín. Kjarnafléttan var skoluð úr dálknum með fimm IMAC stuðpúðum sem innihéldu 100 mM histidín. Brotið sem inniheldur RC-LH114-W fléttuna er þykkt í ~10 ml í hrærðum tanki búinn Amicon 100.000 MWCO síu (Merck, Bretlandi), þynnt 20 sinnum með bindiefni og síðan bætt við 25 ml. Í DEAE Sepharose dálknum eru fjórir CV-söfn bundnir stuðpúðanum notaðir fyrirfram. Þvoið dálkinn með fjórum CV bindingarlausnum, skolið síðan fléttuna út á átta CV með línulegum halla frá 0 til 100 mM NaCl (í bindingarlausn) og hinar fjórar CV-lausnirnar sem eftir voru innihéldu 100 mM bindingarlausn. Leifar af fléttunum sem skoluðust út á natríumklóríði ásamt A880/A280 hlutfallinu hærra en 2,4 og A880/A805 hlutfallinu hærra en 4,6 brotum voru þykkt í ~2 ml í Amicon 100.000 MWCO miðflóttasíu og fyllt með 1,5 CV IMAC fyrirfram jafnvægisstilltri Superdex 200 16/600 stærðarútilokunarsúlu og síðan skolað út í sama lausalausninni yfir 1,5 CV. Safnið gleypnirófum stærðarútilokunarbrotanna og einbeitið gleypnirófin með A880/A280 hlutföllum yfir 2,1 og A880/A805 hlutföllum yfir 4,6 til 100 A880, sem eru strax notuð til að undirbúa fryst TEM-net eða geymd við -80°C þar til þörf er á þeim.
Leica EM GP frystir var notaður til að útbúa lághita TEM net. Flókið var þynnt í IMAC stuðpúða í A880 af 50, og síðan voru 5 μl sett á nýlega glóúthlaðið QUANTIFOIL 1.2/1.3 kolefnishúðað koparnet (Agar Scientific, Bretlandi). Ræktið netið við 20°C og 60% rakastig í 30 sekúndur, þerrið það síðan í 3 sekúndur og kælið það síðan í fljótandi etani við -176°C.
Gögn úr RC-LH114-W fléttunni voru skráð á eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) með Titan Krios smásjá, sem vinnur við 300kV hröðunarspennu, með nafnstækkun upp á 130.000× og orku upp á 20 eV bil. Gatan 968 GIF Quantum með K2 tindamæli var notaður til að taka upp myndir í talningarham til að safna gögnum. Kvörðuð pixlastærð er 1,048 Å og skammtahraðinn er 3,83 e-Å-2s-1. Myndbandið var tekið á 11 sekúndum og skipt í 40 hluta. Notið kolefnishúðaða svæðið til að endurfókusera smásjána og safnaðu síðan þremur myndböndum í hverju gati. Alls voru 3130 myndbönd safnað, með ófókusgildum á milli -1 og -3μm.
Gögnin fyrir RC-LH116 fléttuna voru söfnuð með sama smásjá í Asterbury Biostructure Laboratory (Háskólinn í Leeds, Bretlandi). Gögnunum var safnað með talningarstillingu með 130 k stækkun og pixlastærðin var kvörðuð í 1,065 Å með skammti upp á 4,6 e-Å-2s-1. Myndbandið var tekið upp á 12 sekúndum og skipt í 48 hluta. Alls voru 3359 filmur safnaðar, með ófókusgildi á bilinu -1 til -3 μm.
Öll gagnavinnsla fer fram í Relion 3.0 leiðslunni (42). Notið Motioncorr 2 (43) til að leiðrétta geislahreyfinguna með skammtavigtun og notið síðan CTFFIND 4.1 (44) til að ákvarða CTF (contrast transfer function) breytuna. Dæmigerðar smásjármyndir eftir þessi upphafsvinnslustig eru sýndar á mynd 2. S16. Sjálfvirka valsniðmátið er búið til með því að velja handvirkt um 250 pixla af 1000 ögnum í 250 pixla ramma og án viðmiðunar tvívíðrar (2D) flokkunar, og þar með hafna þeim flokkunum sem uppfylla mengunarkröfur sýnisins eða hafa engin greinanleg einkenni. Síðan var sjálfvirkt val framkvæmt á öllum smásjármyndunum og RC-LH114-W var 849.359 agnir og RC-LH116 fléttan var 476.547 agnir. Allar valdar agnir hafa gengist undir tvær umferðir af tvívíddarflokkun án viðmiðunar, og eftir hverja keyrslu eru agnirnar sem uppfylla kolefnissvæðið, mengun sýnisins, engin augljós einkenni eða skarast mjög hafnað, sem leiðir til 772.033 (90,9%) og 359.678 (75,5%) agna. Agnirnar eru notaðar fyrir þrívíddarflokkun á RC-LH114-W og RC-LH116, talið í sömu röð. Upphaflega þrívíddar viðmiðunarlíkanið var búið til með stokastískri hallaleiðréttingaraðferð. Með því að nota upphafslíkanið sem viðmiðun eru valdar agnir flokkaðar í fjóra flokka í þrívídd. Með því að nota líkanið í þessum flokki sem viðmiðun, framkvæma þrívíddarfínpússun á ögnunum í stærsta flokknum, síðan nota upphaflega 15 Å lágtíðnisíann til að hylja leysiefnasvæðið, bæta við 6 pixlum af mjúkum brúnum og eftirvinnsla pixlanna er framkvæmd til að leiðrétta Gatan K2 hámarksmótunarflutningsfall efsta skynjarans. Fyrir RC-LH114-W gagnasafnið var þessu upphaflega líkani breytt með því að fjarlægja sterka þéttleikann á brúnum grímunnar (ótengdan kjarnaþéttleika fléttunnar í UCSF Chimera). Niðurstöðulíkönin (upplausn RC-LH114-W og RC-LH116 er 3,91 og 4,16 Å, talið í sömu röð) eru notuð sem viðmiðun fyrir aðra umferð þrívíddarflokkunar. Agnirnar sem notaðar voru eru flokkaðar í upphaflega þrívíddarflokkinn og innihalda ekki sterka fylgni við nágrannaagnirnar. Skörun eða skortur á augljósum byggingareiginleikum. Eftir aðra umferð þrívíddarflokkunar var flokkurinn með hæstu upplausn valinn [Fyrir RC-LH114-W er annar flokkurinn 377.703 agnir (44,5%), fyrir RC-LH116 eru tveir flokkar, samtals 260.752 agnir (54,7%), þar sem þær eru aðeins eins þegar þær eru raðaðar eftir upphaflega snúninginn með litlum mun]. Valdar agnir eru endurdregnar í 400 pixla kassa og fínstilltar með þrívíddarfínpússun. Leysiefnismaskan er búin til með því að nota upphaflega 15 Å lágtíðnissíu, 3 pixla kortaukningu og 3 pixla mjúka maska. Með því að nota CTF fínpússun fyrir hverja agn, hreyfingarleiðréttingu fyrir hverja agn og aðra umferð CTF fínpússunar fyrir hverja agn, eru þrívíddarfínpússun, leysiefnisgríma og eftirvinnsla framkvæmd eftir hvert skref til að fínpússa frekar áferðina sem myndast. Með því að nota FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) viðmiðunargildið 0,143, eru upplausnir lokalíkana af RC-LH114-W og RC-LH116 2,65 og 2,80 Å, talið í sömu röð. FSC ferillinn fyrir lokalíkanið er sýndur á mynd 2. S17.
Allar próteinraðir eru sóttar af UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) var notað til að smíða samsvörunarlíkan af RC, sem inniheldur próteinraðir RC-L, RC-M og RC-H og kristalbyggingu Rba. sphaeroides RC var notað sem sniðmát (PDB ID: 5LSE) (46). Notið „fit map“ tólið í UCSF Chimera til að aðlaga myndaða líkanið að kortinu (47), bæta próteinbyggingu og meðvirkniþáttinn [4×BChl a (nafn einliðubókasafnsleifar = BCL), 2×BPh a (BPH), ein eða tvær tegundir af UQ10 (U10), eitt non-heme járn (Fe) og eitt 3,4-díhýdróhexakarbónýlkólín (QAK)] notið Coot (48) til að bæta við. Þar sem QAK er ekki tiltækt í einliðubókasafninu var það stillt á breytur með eLBOW tólinu í PHENIX (49).
Næst var LH1 undireiningin smíðuð. Í upphafi var sjálfvirka smíðatólið í PHENIX (49) notað til að smíða sjálfkrafa hluta af LH1 röðinni með því að nota kortið og LH1-α og LH1-β próteinraðir sem inntak. Veldu heildstæðastu LH1 undireininguna, dragðu hana út og hlaððu henni inn í Coot, bættu handvirkt við þeirri röð sem vantar í hana og fínstilltu handvirkt alla uppbygginguna áður en tveimur BCl-einingum a (BCL) og spirilloxanthin (CRT) var bætt við [samkvæmt viðeigandi Rps Tegundum (17)]. Afritaðu alla LH1 undireininguna og notaðu UCSF Chimera „Docking Map Tool“ til að festa við aðliggjandi svæði sem ekki er líkan af LH1 þéttleika og fínstilltu hana síðan í Coot; endurtaktu ferlið þar til allar LH1 undireiningar hafa verið líkanaðar. Fyrir RC-LH114-W uppbygginguna, með því að draga út óúthlutaða þéttleikann í Coot, er próteinið skipt úr eftirstandandi ópróteinþáttum í USCF Chimera kortinu og Autobuild tólið er notað til að koma á fót upphafslíkaninu og eftirstandandi undireiningum (prótein-W) líkanagerð. Í PHENIX (49). Bætið öllum vantar röðum við niðurstöðulíkanið í Coot (48) og betrumbætið síðan handvirkt alla undireininguna. Eftirstandandi óúthlutaða þéttleikinn passar við samsetningu lípíða (PDB einliðu bókasafnsauðkenni CDL = CDL, POPC = 6PL og POPG = PGT), β-DDM þvottaefni (LMT) og UQ10 sameinda (U10). Notið PHENIX hagræðingu (49) og handvirka hagræðingu í Coot (48) til að fullkomna allt upphafslíkanið þar til tölfræði líkansins og sjónræn gæði aðlögunarinnar er ekki hægt að bæta frekar. Að lokum, notið LocScale (50) til að skerpa staðbundna kortið og framkvæmið síðan nokkrar aðrar lotur af líkanagerð óúthlutaðrar þéttleika og sjálfvirka og handvirka hagræðingu.
Viðkomandi peptíð, meðvirkir þættir og önnur lípíð og kínón, sem eru tengd innan viðkomandi eðlisþyngdar, eru sýnd á myndum 1 og 2. S18 til S23. Tölfræðilegar upplýsingar um lokaútgáfu líkansins eru sýndar í töflu S1.
Nema annað sé tekið fram voru UV/Vis/NIR frásogsrófin tekin með Cary60 litrófsmæli (Agilent, Bandaríkjunum) með 1 nm millibilum frá 250 nm til 1000 nm og með samþættingartíma upp á 0,1 sekúndu.
Þynnið sýnið í kvarskúvettu með 2 mm færi að A880 upp á 1 og safnið gleypnirófinu á milli 400 og 1000 nm. Hringlaga tvílitrófin voru tekin með Jasco 810 litrófsskautunarmæli (Jasco, Japan) með 1 nm millibilum á milli 400 nm og 950 nm við skönnunarhraða 20 nm mín-1.
Mólarslökkvunarstuðullinn er ákvarðaður með því að þynna kjarnafléttuna í A880 sem er um það bil 50. Þynnið 10 μl rúmmálið í 990 μl af bindingarstuðli eða metanóli og safnið frásogsrófinu strax til að lágmarka niðurbrot BChl. BChl innihald hvers metanólsýnis var reiknað með slökkvunarstuðlinum við 771 nm sem er 54,8 mM-1 cm-1 og slökkvunarstuðullinn ákvarðaður (51). Deilið mældum BChl styrk með 32 (RC-LH114-W) eða 36 (RC-LH116) til að ákvarða kjarnafléttustyrkinn, sem síðan er notaður til að ákvarða frásogsróf sama sýnis sem safnað var í stuðpúðanum samsíða. Þrjár endurteknar mælingar voru gerðar fyrir hvert sýni og meðalgleypni BChl Qy hámarksins var notuð til útreiknings. Slökkvistuðullinn fyrir RC-LH114-W mælt við 878 nm er 3280 ± 140 mM-1 cm-1, en slökkvistuðullinn fyrir RC-LH116 mælt við 880 nm er 3800 ± 30 mM-1 cm-1.
UQ10 var magngreint samkvæmt aðferðinni í (52). Í stuttu máli var framkvæmt öfugfasa HPLC (RP-HPLC) með Agilent 1200 HPLC kerfinu. Leysið upp um 0,02 nmól af RC-LH116 eða RC-LH114-W í 50 μl af 50:50 metanól:klóróformi sem inniheldur 0,02% (w/v) járnklóríð og sprautið forjafnvægisstilltu Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 mm uppleystu efni í 1 ml-1 mín-1 við 40°C í HPLC leysi (80:20 metanól:2-própanól) á ×25 cm súlu. Framkvæmið ísókratíska útskiljun í HPLC leysi til að fylgjast með gleypni við 275 nm (UQ10), 450 nm (karótenóíð) og 780 nm (BChl) í 1 klukkustund. Toppurinn í 275 nm litrófinu eftir 25,5 mínútur var samþættur, sem innihélt engin önnur greinanleg efnasambönd. Samþætta flatarmálið er notað til að reikna út mólarmagn UQ10 sem dregið var út með hliðsjón af kvörðunarferlinum sem reiknaður var út frá innspýtingu hreinna staðla frá 0 til 5,8 nmól (mynd S14). Hvert sýni var greint í þremur endurtekningum og tilkynnt skekkjugildi samsvarar staðalfráviki meðaltalsins.
Lausn sem innihélt RC-LH1 fléttuna með hámarks Qy frásog upp á 0,1 var útbúin með 30 μM afoxuðu hestahjarta cýtókrómi c2 (Merck, Bretlandi) og 0 til 50 μMUQ2 (Merck, Bretlandi). Þrjú 1 ml sýni voru útbúin við hvern UQ2 styrk og ræktuð yfir nótt í myrkri við 4°C til að tryggja fullkomna aðlögun að myrkrinu fyrir mælingu. Lausnin var sett í OLIS RSM1000 mát litrófsmæli búinn 300 nm loga/500 línu rifum, 1,24 mm inntaksraufum, 0,12 mm miðjuraufum og 0,6 mm úttaksraufum. 600 nm löng síu er sett við inngang sýnishornsrörsins og viðmiðunarljósmargföldunarrörsins til að útiloka örvunarljós. Gleypnin var fylgst með við 550 nm með samþættingartíma upp á 0,15 sekúndur. Örvunarljósið kemur frá 880 nm M880F2 LED (ljósdíóðu) (Thorlabs Ltd., Bretlandi) í gegnum ljósleiðara með 90% styrkleika í gegnum DC2200 stjórntæki (Thorlabs Ltd., Bretlandi) og er sent til ljósgjafans í 90° horni. Mæligeislinn er á móti speglinum til að skila ljósi sem sýnið frásogaði ekki upphaflega. Fylgist með ljósgleypninni í 10 sekúndur áður en birtustigið er 50 sekúndur. Síðan var ljósgleypnin fylgst enn frekar með í 60 sekúndur í myrkri til að meta í hvaða mæli kínólól dregur sjálfkrafa úr cýtókróm c23+ (sjá mynd S8 fyrir hrágögn).
Gögnunum var unnið með því að aðlaga línulegan upphafshraða innan 0,5 til 10 sekúndna (fer eftir UQ2 styrk) og reikna meðaltal hraða allra þriggja sýnanna við hvern UQ2 styrk. RC-LH1 styrkurinn, reiknaður með viðkomandi útslökkvistuðli, var notaður til að umbreyta hraðanum í hvatavirkni, teiknaður upp í Origin Pro 2019 (OriginLab, Bandaríkjunum) og aðlagaður að Michaelis-Menten líkaninu til að ákvarða sýnileg Km og Kcat gildi.
Fyrir mælingar á tímabundinni frásogsgetu var RC-LH1 sýnið þynnt í ~2μM í IMAC stuðpúða sem innihélt 50 mM natríumaskorbat (Merck, Bandaríkin) og 0,4 mM terbútín (Merck, Bandaríkin). Askorbínsýra er notuð sem fórnarrafeindagjafi og tert-bútaklófen er notað sem QB-hemill til að tryggja að aðal RC-gjafinn haldist afoxaður (þ.e. ekki ljósoxaður) allan mælingarferlið. Um það bil 3 ml af sýninu eru bætt í sérsniðna snúningsfrumu (um 0,1 m í þvermál, 350 snúningar á mínútu) með 2 mm ljósleiðarlengd til að tryggja að sýnið í leysigeislanum hafi nægan tíma til aðlögunar að myrkri milli örvunarpúlsa. Notið ~100-fs leysigeislapúlsa til að magna Ti:Sapphire leysigeislakerfið (Spectra Physics, Bandaríkin) til að örva sýnið við 880 nm með endurtekningartíðni 1 kHz (20 nJ fyrir NIR eða 100 nJ fyrir Vis). Áður en gögnum er safnað skal láta sýnið verða fyrir örvunarljósi í um 30 mínútur. Útsetning mun valda óvirkjun á gæðaeftirliti (hugsanlega minnkandi gæðaeftirlit einu sinni eða tvisvar). En athugið að þetta ferli er afturkræft því eftir langan aðlögunartíma að myrkri mun RC hægt og rólega snúa aftur til gæðaeftirlitsvirkni. Helios litrófsmælir (Ultrafast Systems, Bandaríkin) var notaður til að mæla tímabundin litróf með seinkunartíma frá -10 til 7000 ps. Notið Surface Xplorer hugbúnað (Ultrafast Systems, Bandaríkin) til að aðgreina gagnasöfnin, sameina þau og staðla þau. Notið CarpetView hugbúnaðarpakkann (Light Conversion Ltd., Litháen) til að nota sameinaða gagnasöfnin til að fá mismunadreifingarlitróf sem tengjast rotnun, eða notið fall sem fellur marga veldisvísa með svörun mælitækisins til að passa við litrófsþróun einnar bylgjulengdar í Origin (OriginLab, Bandaríkin).
Eins og áður hefur komið fram (53) var ljóstillífunarfilma sem innihélt LH1 flókið án bæði RC og jaðar-LH2 loftnets útbúin. Himnan var þynnt í 20 mM tris (pH 8,0) og síðan sett í kvarskúvettu með 2 mm ljósleið. 30nJ leysigeisla var notaður til að örva sýnið við 540 nm með seinkunartíma frá -10 til 7000 ps. Vinnið úr gagnasafninu eins og lýst er fyrir Rps. pal sýnið.
Himnan var sett í skilvindu við 150.000 RCF í 2 klukkustundir við 4°C og síðan var gleypni hennar við 880 nm enduruppleyst í 20 mM tris-HCl (pH 8,0) og 200 mM NaCl. Leysið himnuna upp með því að hræra hægt í 2% (w/v) β-DDM í 1 klukkustund í myrkri við 4°C. Sýnið var þynnt í 100 mM tríetýlammoníumkarbónati (pH 8,0) (TEAB; Merck, Bretlandi) þar til próteinþéttni var 2,5 mg ml-1 (Bio-Rad greining). Frekari vinnsla var framkvæmd samkvæmt áður birtri aðferð (54), byrjað á þynningu 50 μg af próteini í samtals 50 μl af TEAB sem innihélt 1% (w/v) natríumlaurat (Merck, Bretlandi). Eftir hljóðbylgju í 60 sekúndur var það afoxað með 5 mM tris(2-karboxýetýl)fosfíni (Merck, Bretlandi) við 37°C í 30 mínútur. Fyrir S-alkýleringu, ræktaðu sýnið með 10 mM metýl S-metýlþíómetansúlfónati (Merck, Bretlandi) og bættu því út í úr 200 mM ísóprópanól stofnlausn í 10 mínútur við stofuhita. Próteinrofsmelting var framkvæmd með því að bæta við 2 μg af trypsíni/endópróteinasa Lys-C blöndu (Promega, Bretlandi) og ræktað við 37°C í 3 klukkustundir. Laurat yfirborðsvirka efnið var dregið út með því að bæta við 50 μl af etýlasetati og 10 μl af 10% (v/v) LC gráðu tríflúorediksýru (TFA; Thermo Fisher Scientific, Bretlandi) og hrista í 60 sekúndur. Fasaaðskilnaðurinn var auðveldaður með skilvindu við 15.700 RCF í 5 mínútur. Samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda var C18 snúningssúla (Thermo Fisher Scientific, Bretlandi) notuð til að soga vandlega og afsalta neðri fasann sem innihélt peptíðið. Eftir þurrkun með lofttæmisskilvindu var sýnið leyst upp í 0,5% TFA og 3% asetónítríli og 500 ng voru greind með nanóflæðis RP litskiljun ásamt massagreiningu með því að nota kerfisbreyturnar sem áður voru tilgreindar.
Notið MaxQuant v.1.5.3.30 (56) til að bera kennsl á og magngreina prótein til að leita að gagnagrunni Rps. palustris próteómsins (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Gögn úr massagreiningu próteómfræðinnar hafa verið geymd í ProteomeXchange Alliance í gegnum samstarfsgagnasafnið PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) undir gagnasafnsauðkenninu PXD020402.
Til greiningar með RPLC ásamt rafúðajónunarmassagreiningu var RC-LH1 flókið búið til úr villtum Rps. Með því að nota áður birta aðferð (16) var próteinþéttni sem framleiddist í palustris frumum 2 mg ml-1 í 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl og 0,03% (w/v) β- (Bio-Rad greining)) DDM. Samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda skal nota 2D hreinsunarbúnað (GE Healthcare, Bandaríkin) til að vinna út 10 μg af próteini með úrfellingaraðferð og leysa upp úrfellinguna í 20 μl af 60% (v/v) maurasýru (FA), 20% (v/v) asetónítríli og 20% ​​(v/v) vatni. Fimm míkrólítrar voru greindir með RPLC (Dionex RSLC) ásamt massagreiningu (Maxis UHR-TOF, Bruker). Notið MabPac 1,2 × 100 mm dálk (Thermo Fisher Scientific, Bretlandi) til aðskilnaðar við 60°C og 100 μl/mín -1, með halla upp á 85% (v / v) leysiefni A [0,1% (v / v) FA og 0,02% (V/v) TFA vatnslausn] á móti 85% (v/v) leysiefni B [0,1% (v/v) FA og 0,02% (v/v) í 90% (v/v) asetónítríl TFA]. Með því að nota staðlaða rafúðajónunargjafa og sjálfgefna breytur í meira en 60 mínútur, nær massagreinirinn 100 til 2750 m/z (massa-til-hleðslu hlutfall). Með hjálp ExPASy lífupplýsingavefsins FindPept tólsins (https://web.expasy.org/findpept/), er massarófið varpað á undireiningar fléttunnar.
Frumurnar voru ræktaðar í 72 klukkustundir undir 100 ml af NF-lágu (10μMm-2 s-1), miðlungs (30μMm-2 s-1) eða háu (300μMm-2 s-1) ljósi. M22 miðill (M22 miðill þar sem ammoníumsúlfat er sleppt og natríumsúkkínati er skipt út fyrir natríumasetat) í 100 ml skrúftappaflösku (23). Í fimm 30 sekúndna lotum voru 0,1 míkron glerperlur settar í rúmmálshlutfallið 1:1 til að leysa frumurnar upp og kældar á ís í 5 mínútur. Óleysanlegt efni, óbrotnar frumur og glerperlur voru fjarlægðar með skilvindu við 16.000 RCF í 10 mínútur í borðmiðflösku. Himnan var aðskilin í Ti 70.1 snúningsröri með 100.000 RCF í 20 mM tris-HCl (pH 8,0) með 40/15% (w/w) súkrósahalla í 10 klukkustundir.
Eins og lýst er í fyrri rannsóknum okkar, ónæmisgreining á His merkinu á PufW (16). Í stuttu máli var hreinsað kjarnaflétta (11,8 nM) eða himna sem innihélt sama styrk af RC (ákvarðað með oxun, dregið frá minnkaða mismunarrófinu og aðlagað álagið á litaða gelið) í 2x SDS hleðslulausn (Merck, Bretlandi) þynnt tvisvar. Próteinin voru aðskilin á eftirlíkingu af 12% bis-tris NuPage geli (Thermo Fisher Scientific, Bretlandi). Gel var litað með Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, Bretlandi) til að hlaða og sjá RC-L undireininguna. Próteinið á öðru gelið var flutt yfir á metanólvirkjaða pólývínýlidenflúoríð (PVDF) himnu (Thermo Fisher Scientific, Bretlandi) til ónæmisprófunar. PVDF himnan var blokkuð í 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,2% (v/v) Tween-20 og 5% (w/v) undanrennudufti og síðan ræktuð með anti-His aðalmótefninu (í 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, Bandaríkjunum) í 4 klukkustundir. Eftir þvott þrisvar sinnum í 5 mínútur í mótefnalausn var himnan blandað saman við piparrótperoxidasa (Sigma-Aldrich, Bretlandi) and-mús auka mótefni (þynnt 1:10.000 í mótefnalausn). Ræktað var til að leyfa greiningu (5 mínútur eftir 3 þvotta í mótefnalausn) með því að nota WESTAR ETA C 2.0 efnaljómunarundirlag (Cyanagen, Ítalíu) og Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Bretlandi).
Með því að teikna styrkdreifingu hvers litaðs gel eða ónæmisprófunarbrautar, samþætta flatarmálið undir tindinum og reikna út styrkhlutfall RC-L (litað gel) og próteins-W (ónæmispróf), í ImageJ (57) var myndinni unnið úr. Þessi hlutföll voru breytt í mólhlutföll með því að gera ráð fyrir að hlutfall RC-L og próteins-W í hreinu RC-LH114-W sýninu væri 1:1 og staðla allt gagnasafnið í samræmi við það.
Sjá nánari upplýsingar um þessa grein á http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Þessi grein er aðgengileg öllum samkvæmt skilmálum Creative Commons Attribution leyfisins. Greinin er heimil ótakmarkaða notkun, dreifingu og afritun í hvaða miðli sem er, að því tilskildu að rétt sé vitnað í upprunalega verkið.
Athugið: Við biðjum þig aðeins um að gefa upp netfangið þitt svo að sá sem þú mælir með á síðunni viti að þú vilt að viðkomandi sjái tölvupóstinn og að hann sé ekki ruslpóstur. Við munum ekki safna neinum netföngum.
Þessi spurning er notuð til að kanna hvort þú sért gestur og koma í veg fyrir sjálfvirka ruslpóstsendingu.
David J.K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Háskerpuupplausn ljósgildru 1 fléttunnar í hvarfmiðstöðinni veitir nýja innsýn í gangvirkni kínóna.
David J.K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Háskerpuupplausn ljósgildru 1 fléttunnar í hvarfmiðstöðinni veitir nýja innsýn í gangvirkni kínóna.
©2021 American Association for the Advancement of Science. allur réttur áskilinn. AAAS er samstarfsaðili HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef og COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.