Núverandi *Núverandi heimilisfang: Köln 50931, Þýskalandi, Köln Excellence Cluster Research on Cellular Stress Response in Aging-related Diseases (CECAD).
Taugahrörnun hvatberasjúkdóma er talin óafturkræf þar sem efnaskiptaplastik taugafrumna er takmörkuð, en áhrif truflunar á hvatberastarfsemi á sjálfstæði frumna í taugaefnaskiptum í líkamanum eru illa skilin. Hér kynnum við frumu-sértækt prótein í Purkinje-taugafrumnum með versnandi OXPHOS-skorti sem orsakast af truflun á hvatberasamruna. Við komumst að því að truflun á hvatberastarfsemi olli djúpstæðri breytingu á sviði próteómfræði, sem að lokum leiddi til raðbundinnar virkjunar nákvæmra efnaskiptaferla fyrir frumudauða. Óvænt komumst við að því að við greinilega örvun pýrúvatkarboxýlasa (PCx) og annarra öldrunarhemjandi ensíma sem bæta upp milliefni TCA-hringrásarinnar. Hömlun á PCx jók oxunarálag og taugahrörnun, sem bendir til þess að æðakölkun hafi verndandi áhrif í taugafrumum sem skortir OXPHOS. Endurreisn hvatberasamruna í taugafrumum með lokastig hrörnunar snýr þessum efnaskiptaeiginleikum alveg við og kemur þannig í veg fyrir frumudauða. Niðurstöður okkar benda á áður óþekktar leiðir sem veita seiglu gegn truflunum á hvatberastarfsemi og sýna að taugahrörnun er hægt að snúa við jafnvel á síðari stigum sjúkdómsins.
Lykilhlutverk hvatbera í að viðhalda orkuefnaskiptum taugafruma er undirstrikað af víðtækum taugasjúkdómum sem tengjast hvatberasjúkdómum hjá mönnum. Flestir þessara sjúkdóma eru af völdum stökkbreytinga í genum sem stjórna tjáningu hvatbera (1, 2) eða eyðileggingu gena sem tengist hvatberahreyfingum, sem hafa óbein áhrif á stöðugleika hvatbera DNA (mtDNA) (3, 4). Rannsóknir í dýralíkönum hafa sýnt að viðbrögð við truflunum á hvatberum í nærliggjandi vefjum geta íhaldssamar efnaskiptaleiðir (5-7) virkjast, sem veitir mikilvægar upplýsingar fyrir ítarlega skilning á meingerð þessara flóknu sjúkdóma. Í mikilli andstæðu við þetta er skilningur okkar á efnaskiptabreytingum tiltekinna frumugerða af völdum almennrar bilunar í framleiðslu adenosíntrífosfats (ATP) hvatbera í heila grundvallaratriði (8), sem undirstrikar þörfina á að bera kennsl á meðferðarmarkmið sem hægt er að nota til að koma í veg fyrir eða koma í veg fyrir sjúkdóma. Koma í veg fyrir taugahrörnun (9). Skortur á upplýsingum stafar af því að almennt er talið að taugafrumur hafi mjög takmarkaðan sveigjanleika í efnaskiptum samanborið við frumugerðir í nærliggjandi vefjum (10). Þar sem þessar frumur gegna lykilhlutverki í að samhæfa framboð umbrotsefna til taugafrumna til að stuðla að taugamótaflutningi og bregðast við meiðslum og sjúkdómum, er hæfni þeirra til að aðlaga frumuefnaskipti að krefjandi aðstæðum heilavefjar nánast takmörkuð við glialfrumur (11-14). Þar að auki hindrar meðfædd frumumisleitni heilavefjar að miklu leyti rannsóknir á efnaskiptabreytingum sem eiga sér stað í tilteknum taugafrumuundirhópum. Þar af leiðandi er lítið vitað um nákvæmar frumu- og efnaskiptaafleiðingar hvatberastarfsemi í taugafrumum.
Til að skilja efnaskiptaafleiðingar truflunar á hvatberum, einangruðum við Purkinje taugafrumur (PN) á mismunandi stigum taugahrörnunar sem orsakast af eyðingu á ytri himnu hvatbera (Mfn2). Þó að Mfn2 stökkbreytingar í mönnum séu tengdar við arfgengan hreyfitaugakvilla sem kallast Charcot-Marie-Tooth gerð 2A (15), er skilyrt eyðilegging Mfn2 í músum vel þekkt aðferð til að örva oxunar fosfórun (OXPHOS) truflun. Ýmsar taugafrumugerðir (16-19) og afleidd taugahrörnunarsvipgerð fylgja versnandi taugaeinkenni, svo sem hreyfitruflanir (18, 19) eða litlaheilahreyfingar (16). Með því að nota samsetningu af merkingarlausri megindlegri (LFQ) próteómfræði, efnaskiptafræði, myndgreiningu og veirufræðilegum aðferðum, sýnum við fram á að versnandi taugahrörnun örvar sterklega pýrúvat karboxýlasa (PCx) og aðra þætti sem taka þátt í æðakölkun PN in vivo tjáningu ensíma. Til að staðfesta mikilvægi þessarar niðurstöðu niðurstýrðum við sérstaklega tjáningu PCx í Mfn2-skortum taugafrumum og komumst að því að þessi aðgerð jók oxunarálag og flýtti fyrir taugahrörnun, sem sannaði þannig að sæðisleysi veldur frumudauða og aðlögunarhæfni til efnaskipta. Alvarleg tjáning MFN2 getur alveg bjargað lokastigi taugahrörnunar með alvarlegum OXPHOS skorti, mikilli neyslu á hvatbera DNA og greinilega brotnu hvatberaneti, sem undirstrikar enn frekar að þessi tegund taugahrörnunar getur jafnvel náð sér á strik á langt gengnu stigi sjúkdómsins áður en frumudauði á sér stað.
Til að sjá hvatberana í Mfn2-útsláttarfrumum notuðum við músastofn sem gerir Cre-háðum hvatberum kleift að miða á Cre-tjáningu í gulu flúrljómandi próteini (YFP) (mtYFP) (20) og athuguðum hvatberaformgerð in vivo. Við komumst að því að eyðilegging Mfn2-gensins í PN myndi leiða til smám samanrofs hvatberanetsins (mynd S1A) og fyrstu breytingin fannst við 3 vikna aldur. Aftur á móti hófst veruleg hrörnun PN-frumulagsins, eins og sést af tapi á Calbindin-ónæmislitun, ekki fyrr en við 12 vikna aldur (mynd 1, A og B). Tímamisræmið milli fyrstu breytinga á hvatberaformgerð og sýnilegs upphafs taugafrumudauða hvatti okkur til að rannsaka efnaskiptabreytingar sem koma af stað af völdum truflunar á hvatberum fyrir frumudauða. Við þróuðum aðferð byggða á flúrljómunarvirkjaðri frumuflokkun (FACS) til að einangra YFP (YFP+)-tjáandi PN (mynd 1C), og í samanburðarmúsum (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), hér eftir nefnd CTRL (mynd S1B). Bestun á lykkjuaðferðinni byggð á hlutfallslegum styrk YFP merkisins gerir okkur kleift að hreinsa YFP+ líkamann (YFPHigh) af PNs frá non-PNs (YFPneg) (mynd S1B) eða hugsanlegum flúrljómandi taugasíma/griputaugabrotum (YFPlow; mynd S1D, vinstra megin), staðfest með confocal smásjá (mynd S1D, hægra megin). Til að staðfesta auðkenni flokkaða þýðisins framkvæmdum við LFQ próteómfræði og síðan aðalþáttagreiningu og komumst að því að það er skýr aðskilnaður á milli YFPHigh og YFPneg frumna (mynd S1C). YFPhigh frumur sýndu nettóauðgun þekktra PN merkja (þ.e. Calb1, Pcp2, Grid2 og Itpr3) (21, 22), en enga auðgun próteina sem almennt eru tjáð í taugafrumum eða öðrum frumugerðum (Mynd 1D)). Samanburður á sýnum í flokkuðum YFPhigh frumum sem safnað var í óháðum tilraunum sýndi fylgnistuðul > 0,9, sem sýnir góða endurtekningarhæfni milli líffræðilegra endurtekninga (Mynd S1E). Í stuttu máli staðfestu þessi gögn áætlun okkar um bráða og sértæka einangrun á mögulegum PN. Þar sem L7-cre drifkerfið sem notað er veldur mósaík endurröðun fyrstu vikuna eftir fæðingu (23), byrjuðum við að útrýma mýs úr CTRL og skilyrtum (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) söfnuðum taugafrumum. Eftir að endurröðun er lokið er það kallað Mfn2cKO við 4 vikna aldur. Sem endapunkt völdum við 8 vikna aldur þegar PN lagið var óskemmd þrátt fyrir augljósa sundrun hvatbera (Mynd 1B og Mynd S1A). Alls magngreindum við alls 3013 prótein, þar af voru um 22% byggð á MitoCarta 2.0 skýringum byggðum á hvatberapróteininu sem hvatberum (Mynd 1E) (Mynd 1E) (24). Mismunandi genatjáningargreining sem framkvæmd var í 8. viku sýndi að aðeins 10,5% allra próteina höfðu marktækar breytingar (Mynd 1F og Mynd S1F), þar af voru 195 prótein niðurstýrð og 120 prótein uppstýrð (Mynd 1F). Það er vert að taka fram að „nýstárleg ferlagreining“ þessa gagnasafns sýnir að mismunandi tjáð genin tilheyra aðallega takmörkuðu mengi sértækra efnaskiptaferla (Mynd 1G). Athyglisvert er að þó að niðurstýring á ferlum sem tengjast OXPHOS og kalsíumboðum staðfesti örvun truflunar á starfsemi hvatbera í boðefnum með samrunaskort, þá eru aðrir flokkar sem aðallega fela í sér amínósýruumbrot verulega uppstýrðir, sem er í samræmi við umbrot sem eiga sér stað í boðefnum með hvatbera. Endurrafmagnsröskun er stöðug.
(A) Dæmigerðar confocal ljósmyndir af litlaheilasneiðum CTRL og Mfn2cKO músa sem sýna stigvaxandi tap á PN (calbindin, grátt); kjarnar voru mótlitaðir með DAPI. (B) Magngreining á (A) (einhliða dreifingargreining, ***P<0,001; n = 4 til 6 hringir frá þremur músum). (C) Tilraunavinnuflæði. (D) Dreifing hitakorts á merkjum sem eru sértækir fyrir Purkinje (efst) og aðrar frumugerðir (miðja). (E) Venn-mynd sem sýnir fjölda hvatberapróteina sem greindust í flokkuðu PN. (F) Eldfjallamynd af mismunandi tjáðum próteinum í Mfn2cKO taugafrumum eftir 8 vikur (marktækniþröskuldur 1,3). (G) Greining á sköpunarferli sýnir fimm mikilvægustu uppstýringar- (rautt) og niðurstýringar- (blát) ferlana í Mfn2cKO PN flokkuðu sem 8 vikur. Meðal tjáningarstig hvers greinds próteins er sýnt. Grátóna hitakort: leiðrétt P gildi. ns, ekki mikilvægt.
Próteómfræðilegar niðurstöður sýndu að prótíntjáning fléttna I, III og IV minnkaði smám saman. Fléttur I, III og IV innihéldu allar nauðsynlegar mtDNA-kóðaðar undireiningar, en flétta II, sem var aðeins kjarnakóðuð, var nánast óbreytt (Mynd 2A og Mynd S2A). Í samræmi við niðurstöður próteómfræðilegra rannsókna sýndi ónæmisvefjafræði á vefjasneiðum úr litla heilanum að MTCO1 (hvatbera cýtókróm C oxídasa undireining 1) undireiningarstig fléttu IV í PN minnkaði smám saman (Mynd 2B). Mtatp8 undireiningin, sem mtDNA-kóðuð er, minnkaði marktækt (Mynd S2A), en stöðugt stig kjarnakóðaðrar ATP syntasa undireiningar var óbreytt, sem er í samræmi við þekkta stöðuga ATP syntasa undirsamsetningar F1 fléttuna þegar mtDNA tjáning er stöðug. Myndunin er stöðug. Stöðvun (7). Mat á mtDNA magni í flokkuðum Mfn2cKO PNs með rauntíma pólýmerasa keðjuverkun (qPCR) staðfesti stigvaxandi lækkun á fjölda mtDNA afrita. Í samanburði við samanburðarhópinn, við 8 vikna aldur, var aðeins um 20% af mtDNA magni eftir (Mynd 2C). Í samræmi við þessar niðurstöður var confocal smásjárlitun á Mfn2cKO PNs notuð til að greina DNA, sem sýnir tímaháða neyslu hvatbera núkleótíða (Mynd 2D). Við komumst að því að aðeins sumir frambjóðendur sem taka þátt í niðurbroti hvatberapróteina og streituviðbrögðum voru uppstýrðir, þar á meðal Lonp1, Afg3l2 og Clpx, og OXPHOS flóknu samsetningarþættir. Engar marktækar breytingar á magni próteina sem taka þátt í stýrðum frumudauða greindust (Mynd S2B). Á sama hátt komumst við að því að hvatberar og endoplasmic reticulum rásir sem taka þátt í kalsíumflutningi hafa aðeins minniháttar breytingar (Mynd S2C). Að auki leiddi mat á próteinum tengdum sjálfsáti í ljós engar marktækar breytingar, sem er í samræmi við sýnilega örvun sjálfsátfrumna sem sést in vivo með ónæmisvefjaefnafræði og rafeindasmásjá (mynd S3). Hins vegar fylgir vaxandi OXPHOS-truflun í æðakölkun augljósum breytingum á frumubyggingu hvatbera. Hvatberaklasar má sjá í frumulíkömum og griputrjám Mfn2cKO æðakölkunarfrumna á aldrinum 5 og 8 vikna, og innri himnubygging hefur gengist undir miklar breytingar (mynd S4, A og B). Í samræmi við þessar frumubyggingarbreytingar og marktæka lækkun á mtDNA, sýndi greining á bráðum heila-litla sneiðum með tetrametýlrhodamín metýl ester (TMRM) að möguleiki hvatberahimnu í Mfn2cKO æðakölkunarfrumnum minnkaði marktækt (mynd S4C).
(A) Tímagreining á tjáningarstigi OXPHOS fléttunnar. Aðeins skal skoða prótein með P < 0,05 eftir 8 vikur (tvíhliða ANOVA). Punktalína: Engin aðlögun miðað við CTRL. (B) Vinstri: Dæmi um litlaheilasneið merkt með MTCO1 mótefni (kvarðastika, 20 μm). Svæðið sem Purkinje frumulíkaminn tekur er þakið gulu. Hægri: Magngreining á MTCO1 gildum (einhliða dreifingargreining; n = 7 til 20 frumur greindar úr þremur músum). (C) qPCR greining á mtDNA afritafjölda í flokkuðu PN (einhliða dreifingargreining; n = 3 til 7 mýs). (D) Vinstri: Dæmi um litlaheilasneið merkt með DNA mótefni (kvarðastika, 20 μm). Svæðið sem Purkinje frumulíkaminn tekur er þakið gulu. Hægri: Magngreining á mtDNA meinsemdum (einhliða dreifingargreining; n = 5 til 9 frumur úr þremur músum). (E) Dæmi um bráða litlaheilasneið sem sýnir mítóYFP + Purkinje frumur (ör) í heilfrumuklemmuupptöku. (F) Magnbundin ákvörðun á IV ferli. (G) Dæmigerðar upptökur af afskautunarstraumsinnspýtingu í CTRL og Mfn2cKO Purkinje frumum. Efri ferill: Fyrsti púlsinn sem virkjaði AP. Neðri ferill: Hámarks AP tíðni. (H) Magnbundin ákvörðun á eftirsynaptískum sjálfsprottnum inntökum (sPSPs). Dæmigerð upptökuferill og aðdráttarhlutfall hans eru sýnd í (I). Einhliða dreifnigreining greind n = 5 til 20 frumur úr þremur músum. Gögn eru gefin upp sem meðaltal ± SEM; *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001. (J) Dæmigerðar upptökur af sjálfsprottnum AP skráðar með gataðri klemmustillingu. Efri ferill: Hámarks AP tíðni. Neðri ferill: aðdráttur á einni AP. (K) Magnbundið meðal- og hámarks AP tíðni samkvæmt (J). Mann-Whitney próf; n = 5 frumur voru greindar úr fjórum músum. Gögn eru gefin upp sem meðaltal ± staðalfrávik (SEM); ekki mikilvægt.
Greinileg OXPHOS-skemmdir greindust í 8 vikna gömlum Mfn2cKO PN, sem bendir til þess að lífeðlisfræðileg virkni taugafrumna sé alvarlega óeðlileg. Þess vegna greindum við óvirka rafeiginleika OXPHOS-skorts taugafrumna við 4 til 5 vikur og 7 til 8 vikur með því að framkvæma heilfrumuklemmuupptökur í bráðum litlaheilasneiðum (Mynd 2E). Óvænt var meðal hvíldarhimnuspenna og inntaksviðnám Mfn2cKO taugafrumna svipuð og í samanburðarhópnum, þó að það væri lúmskur munur á milli frumna (Tafla 1). Á sama hátt fundust engar marktækar breytingar á straum-spennu sambandinu (IV ferill) við 4 til 5 vikna aldur (Mynd 2F). Hins vegar lifðu engar Mfn2cKO taugafrumur 7 til 8 vikna gamlar IV meðferðina (ofskautunarskref), sem bendir til þess að greinileg næmi sé fyrir ofskautunarmöguleikum á þessu síðari stigi. Aftur á móti, í Mfn2cKO taugafrumum, eru afskautunarstraumar sem valda endurteknum útblæstri boðspennu (AP) vel þolanlegir, sem bendir til þess að heildarútblæstri þeirra sé ekki marktækt frábrugðið þeim sem eru í 8 vikna gömlum samanburðartaugafrumum (Tafla 1 og Mynd 2G). Á sama hátt var tíðni og sveifluvídd sjálfsprottinna eftirsynaptískra strauma (sPSC) sambærileg við samanburðarhópinn og tíðni atburða jókst úr 4 vikum í 5 vikur í 7 vikur í 8 vikur með svipaðri aukningu (Mynd 2, H og I). Tímabil synaptískrar þroska í PNs (25). Svipaðar niðurstöður fengust eftir götóttar PN plástra. Þessi stilling kemur í veg fyrir mögulega bætur fyrir frumu-ATP galla, eins og gæti gerst í heilfrumu plástursklemmu upptöku. Einkum var hvíldarhimnu boðspenna og sjálfsprottin skottíðni Mfn2cKO taugafrumna ekki fyrir áhrifum (Mynd 2, J og K). Í stuttu máli benda þessar niðurstöður til þess að hjartalínurit með greinilega OXPHOS-truflun geti tekist vel á við hátíðni útblástursmynstur, sem bendir til þess að til staðar sé jöfnunarkerfi sem gerir þeim kleift að viðhalda nær eðlilegum raflífeðlisfræðilegum svörum.
Gögnin eru gefin upp sem meðaltal ± staðalfráviksstuðull (einhliða dreifigreining, margfeldis samanburðarpróf Holm-Sidak; *P < 0,05). Einingarnúmerið er gefið til kynna með sviga.
Við lögðum áherslu á að kanna hvort einhver flokkur í próteómfræðigagnagrunninum (mynd 1G) innihaldi ferla sem geta unnið gegn alvarlegum OXPHOS skorti og þar með útskýrt hvers vegna áhrif á PN geta viðhaldið nær eðlilegri rafgreiningu (mynd 2, E til K). . Próteómfræðigreining sýndi að ensímin sem taka þátt í niðurbroti greinóttra amínósýra (BCAA) voru marktækt uppstýrð (mynd 3A og mynd S5A) og lokaafurðin asetýl-CoA (CoA) eða súksínýl CoA geta bætt við tríkarboxýlöt í æðakölkunarsýruhringrásinni (TCA). Við komumst að því að innihald BCAA transamínasa 1 (BCAT1) og BCAT2 jókst bæði. Þau hvata fyrsta skrefið í niðurbroti BCAA með því að mynda glútamat úr α-ketóglútarati (26). Allar undireiningar sem mynda greinótta ketosýru dehýdrógenasa (BCKD) fléttuna eru uppstýrðar (fléttan hvatar síðari og óafturkræfa afkarboxýleringu á kolefnisgrind BCAA sem myndast) (Mynd 3A og Mynd S5A). Hins vegar fundust engar augljósar breytingar á BCAA sjálfu í flokkuðu PN, sem gætu stafað af aukinni frumuupptöku þessara nauðsynlegu amínósýra eða notkun annarra uppspretta (glúkósa eða mjólkursýru) til að bæta við TCA hringrásina (Mynd S5B). PN sem skorti OXPHOS sýndu einnig aukna niðurbrot glútamíns og transamíneringarvirkni við 8 vikna aldur, sem endurspeglast í uppstýringu hvatberaensímanna glútamínasa (GLS) og glútamínpýrúvat transamínasa 2 (GPT2) (Mynd 3, A og C). Það er vert að taka fram að uppstjórnun GLS er takmörkuð við splæsaða ísóformið glútamínasa C (GLS-GAC) (breytingin á Mfn2cKO/CTRL er um það bil 4,5-föld, P = 0,05), og sértæk uppstjórnun þess í krabbameinsvefjum getur stutt líforku hvatbera. (27).
(A) Hitakortið sýnir margfeldisbreytingu á próteinmagni fyrir tilgreinda leið eftir 8 vikur. (B) Dæmi um litlaheilasneið merkta með PCx mótefni (kvarðastika, 20 μm). Gula örin bendir á Purkinje frumubolinn. (C) Tímabundin próteintjáningargreining auðkennd sem mikilvægur þáttur í æðakölkun (margfeldi t-próf, *FDR <5%; n = 3-5 mýs). (D) Hér að ofan: Skýringarmynd sem sýnir mismunandi leiðir til að komast inn í merkt kolefni sem er í [1-13C]pýrúvat sporefninu (þ.e. í gegnum PDH eða slagæðaleið). Neðst: Fiðlukortið sýnir hlutfall einmerkts kolefnis (M1) sem breyttist í aspartsýru, sítrónusýru og eplasýru eftir að bráðar litlaheilasneiðar voru merktar með [1-13C]pýrúvati (parað t-próf; ** P <0,01). (E) Ítarleg tímasögugreining á tilgreindri leið. Aðeins skal taka tillit til próteina með P <0,05 eftir 8 vikur. Strikalína: ekkert leiðréttingargildi (tvíhliða dreifigreining; * P <0,05; *** P <0,001). Gögn eru gefin upp sem meðaltal ± staðalfrávik.
Í greiningu okkar hefur niðurbrot BCAA orðið ein af lykil uppstýringarleiðunum. Þessi staðreynd bendir sterklega til þess að loftræstimagn sem fer inn í TCA hringrásina gæti breyst í taugafrumum sem skortir OXPHOS. Þetta gæti verið mikilvæg form af endurskipulagningu taugaefnaskipta, sem gæti haft bein áhrif á taugalífeðlisfræði og lifun meðan alvarleg OXPHOS truflun er viðhaldin. Í samræmi við þessa tilgátu komumst við að því að aðal æðakölkunarhemjandi ensímið PCx er uppstýrt (Mfn2cKO/CTRL breytist um það bil 1,5 sinnum; Mynd 3A), sem hvatar umbreytingu pýrúvats í oxalóasetat (28), sem talið er að sé í heilavef. Tjáningin er takmörkuð við stjörnufrumur (29, 30). Í samræmi við niðurstöður próteómfræðinnar sýndi confocal smásjárskoðun að PCx tjáning jókst sérstaklega og marktækt í OXPHOS-skortandi taugafrumum, en PCx viðbrögð voru aðallega takmörkuð við aðliggjandi Bergmann glialfrumur í samanburðarhópnum (Mynd 3B). Til að prófa virkni uppstýringar á PCx, meðhöndluðum við bráðar litlaheilasneiðar með [1-13C]pýrúvatsporefni. Þegar pýrúvat var oxað með pýrúvat dehýdrógenasa (PDH) hvarf samsætumerki þess, en það er innlimað í milliefni TCA hringrásarinnar þegar pýrúvat er umbrotið með æðaviðbrögðum (mynd 3D). Til stuðnings próteómgögnum okkar sáum við fjölda merkja frá þessu sporefni í aspartsýru Mfn2cKO sneiðanna, en sítrónusýra og eplasýra sýndu einnig miðlungsmikla tilhneigingu, þó ekki marktæka (mynd 3D).
Í dópamín taugafrumum MitoPark músa með truflun á hvatberum vegna þess að dópamín taugafrumur eyðilögðu sérstaklega genið fyrir umritunarþátt A hvatbera (Tfam) (mynd S6B), var tjáning PCx einnig marktækt uppstýrð (31), sem bendir til að asetonsýru æðakölkun sé stýrð við truflun á taugafrumum OXPHOS í líkamanum. Það er vert að taka fram að það hefur komið í ljós að einstök ensím (32-34) sem geta verið tjáð í taugafrumum sem geta tengst æðakölkun eru marktækt uppstýrð í taugafrumum sem skortir OXPHOS, svo sem própíónýl-CoA karboxýlasa (PCC-A), malónýl-CoA breytir própíónýl-CoA í súksínýl-CoA og hvatbera eplaensím 3 (ME3), sem aðalhlutverk er að endurheimta pýrúvat úr malati (mynd 3, A og C) (33, 35). Að auki fundum við marktæka aukningu á Pdk3 ensíminu, sem fosfórýlerar og þannig óvirkjar PDH (36), en engar breytingar greindust á Pdp1 ensíminu sem virkjar PDH eða PDH ensímfléttunni sjálfri (Mynd 3A). Samkvæmt, í Mern2cKO PNs, jókst fosfórun á α1 undireiningunni α (PDHE1α) undireiningunni í pyruvat dehýdrógenasa E1 hluta PDH fléttunnar í Ser293 (þekkt fyrir að hamla ensímvirkni PDH) (Mynd S6C) (Mynd S6C). Pyruvat hefur engan aðgang að æðum.
Að lokum komumst við að því að ofurleið seríns og glýsíns myndunar, tengdur fólathringur hvatbera (1C) og prólín myndun (mynd 1G og mynd S5C) eru öll marktækt uppstýrð, samkvæmt skýrslum, meðan á virkjunarferlinu stendur. Nærliggjandi vefir eru virkjaðir með truflun á hvatberum (5-7). Samsvörunargreining sem styður þessi próteómgögn sýndi að í næmiskerfinu (PN) þar sem OXPHOS vantar voru litlaheilasneiðar af 8 vikna gömlum músum látnar meðhöndla serín hýdroxýmetýltransferasa 2 (SHMT2), lykilensím í fólathring hvatbera. Marktæk ónæmissvörun (mynd S5D). Í 13 bráðum litlaheilasneiðum sem voru ræktaðar með CU-glúkósa staðfestu efnaskiptarakningartilraunir enn frekar uppstýringu á seríns og prólíns myndun, sem bendir til þess að flæði kolefnisísóforma í serín og prólín aukist (mynd S5E). Þar sem viðbrögðin sem GLS og GPT2 stuðla að bera ábyrgð á myndun glútamíns úr glútamíni og transamíneringu milli glútamíns og α-ketóglútarats, bendir uppstýring þeirra til þess að OXPHOS-skortir taugafrumur hafi aukna eftirspurn eftir glútamati. Þetta gæti verið markmiðið að viðhalda aukinni prólínmyndun (mynd S5C). Ólíkt þessum breytingum sýndi próteingreining á litla heilastjörnufrumum úr PN-sértækum Mfn2cKO músum að þessar leiðir (þar með taldar allar andperoxidasar) breyttust ekki marktækt í tjáningu, sem sýnir fram á að þessi efnaskiptabreyting er sértæk fyrir niðurbrotið PN (mynd S6, D til G).
Í stuttu máli leiddu þessar greiningar í ljós marktækt mismunandi mynstur tímabundinnar virkjunar á tilteknum efnaskiptaferlum í næmum heilaæðum. Þó að óeðlileg starfsemi taugafruma í hvatberum geti leitt til snemmbúinnar æðakölkunar og endurgerðar 1C (mynd 3E og mynd S5C), og jafnvel fyrirsjáanlegra breytinga á tjáningu I og IV fléttna, eru breytingarnar á serín de novo myndun aðeins augljósar á síðari stigum. OXPHOS truflun (mynd 3E og mynd S5C). Þessar niðurstöður skilgreina raðbundið ferli þar sem streituvaldandi hvatberar (1C hringrás) og umfrymis (serín myndun) bregðast samverkandi við aukningu á æðakölkun í TCA hringrásinni til að endurmóta taugaefnaskipti.
Átta vikna gamlir OXPHOS-skortir taugafrumur geta viðhaldið hátíðni örvunarvirkni og gengist undir verulega efnaskiptatengingu til að bæta upp fyrir truflun á starfsemi hvatbera. Þessi uppgötvun vekur upp áhugaverðan möguleika á því að jafnvel á þessum tímapunkti gætu þessar frumur einnig fengið meðferðarúrræði til að seinka eða koma í veg fyrir taugahrörnun. Við leystum þennan möguleika með tveimur óháðum íhlutunum. Í fyrri aðferðinni hönnuðum við Cre-háðan adenótengdan veiru (AAV) vektor þannig að MFN2 geti verið sértækt tjáð í OXPHOS-skortum taugafrumum in vivo (Mynd S7A). AAV sem kóðar fyrir MFN2 og flúrljómandi fréttargenið mCherry (Mfn2-AAV) voru staðfest í frumtaugafrumuræktunum in vitro, sem olli því að MFN2 var tjáð á Cre-háðan hátt og bjargaði hvatberaformgerðinni, og þar með komið í veg fyrir taugastökkbreytingu í Mfn2cKO taugafrumum (Mynd S7, B, D og E). Næst framkvæmdum við tilraunir in vivo til að afhenda 8 vikna gamla Mfn2-AAV með staðbundinni aðferð í litlaheilabörk Mfn2cKO- og samanburðarmúsa og greindum 12 vikna gamlar mýs (Mynd 4A). Meðhöndluðu Mfn2cKO-mýsnar dóu (Mynd 1, A og B) (16). Veiruflutningur in vivo leiddi til sértækrar tjáningar á PN í sumum litlaheilahringjum (Mynd S7, G og H). Innspýting á samanburðar-AAV sem tjáði aðeins mCherry (Ctrl-AAV) hafði engin marktæk áhrif á taugahrörnunarstig í Mfn2cKO-dýrum. Aftur á móti sýndi greining á Mfn2cKO sem voru umbreytt með Mfn2-AAV marktæk verndandi áhrif PN-frumulagsins (Mynd 4, B og C). Einkum virðist taugafrumuþéttleikinn vera nánast óaðgreinanlegur frá samanburðardýrunum (Mynd 4, B og C, og Mynd S7, H og I). Tjáning MFN1 en ekki MFN2 er jafn áhrifarík við að koma í veg fyrir taugafrumudauða (mynd 4C og mynd S7, C og F), sem bendir til þess að tjáning á utanlegsfrumu MFN1 geti á áhrifaríkan hátt bætt upp skort á MFN2. Frekari greining á einu PN stigi sýndi að Mfn2-AAV bjargaði að mestu leyti öfgabyggingu hvatbera, eðlilegði mtDNA gildi og sneri við mikilli tjáningu PCx, sem er merki um æðamyndun (mynd 4, C til E). Sjónræn skoðun á björguðum Mfn2cKO músum í hvíldarstöðu sýndi að líkamsstaða þeirra og hreyfieinkenni (hreyfingar S1 til S3) batnuðu. Að lokum sýna þessar tilraunir að seinkað endurkoma MFN2 í PN sem skortir verulega OXPHOS er nægjanleg til að snúa við mtDNA neyslu og valda æðakölkun, og þar með koma í veg fyrir hrörnun taugasíma og taugafrumudauða in vivo.
(A) Skýringarmynd sem sýnir tilraunaáætlun fyrir inndælingu AAV sem kóðar fyrir MFN2 þegar tilgreind efnaskiptaleið er virkjuð. (B) Dæmigerðar confocal myndir af 12 vikna gömlum litlaheilasneiðum sem voru umritaðar 8 vikum eftir umritun í Mfn2cKO músum og merktar með and-Calbindin mótefni. Hægra megin: Stærð taugasímaþráða. Stærð aðdráttar taugasímans er 450 og 75 μm. (C) Vinstra megin: Magnbundin ákvörðun á Purkinje frumufrumnaþéttleika í AAV umritunarlykkjunni (AAV+) (einhliða dreifingargreining; n = 3 mýs). Hægra megin: mtDNA fókusgreining í umrituðum frumuboðefnum eftir 12 vikur (óparað t-próf; n = 6 frumur frá þremur músum). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Dæmigerðar rafeindasmásjármyndir af frumuboðefnum úr Mfn2cKO litlaheilasneiðum sem umritaðar voru með tilgreindum veiruvigrum. Bleika gríman sýnir svæðið sem dendrítar taka upp og guli punktamerkti ferningurinn sýnir aðdráttinn sem er gefinn til hægri; n táknar kjarnann. Kvarðastika, 1μm. (E) sýnir dæmi um PCx litun í PN sem var erfðabreyttur eftir 12 vikur. Kvarðastika, 20μm. OE, ofurtjáning; FC, margföldunarbreyting.
Að lokum rannsökuðum við mikilvægi peroxidasa-örvaðrar frumulifunar í æðakölkun (PNs) sem hafa upplifað OXPHOS truflun. Við mynduðum mCherry sem kóðar fyrir AAV-shRNA (short hairnail RNA) sem miðaði sérstaklega á músa PCx mRNA (AAV-shPCx) og sprautuðum veirunni eða samanburðarviðtaka hennar (AAV-scr) í litla heila Mfn2cKO músa. Innspýtingin var framkvæmd á fjórðu viku aldurs (Mynd 5A) til að ná fram virkri niðurfellingu PCx á þeim tíma þegar PCx ​​tjáning jókst (Mynd 3C) og PN frumulagið var enn óskemmd (Mynd 1A). Það er vert að taka fram að niðurfelling PCx (Mynd S8A) leiðir til verulegrar hröðunar á PN dauða, sem takmarkast við sýkta hringinn (Mynd 5, B og C). Til að skilja verkunarháttur efnaskiptaáhrifa sem PCx-uppstýring veldur, rannsökuðum við oxunar-afoxunarstöðu PN eftir PCx-niðurslátt og AAV-miðlað ljósfræðilegt líffræðilegt skynjara Grx1-roGFP2 voru tjáð samtímis (Mynd S8, B til D) til að meta hlutfallslega breytingu á oxunar-afoxunarmöguleika peptíða (38). Síðan framkvæmdum við tveggja ljóseinda flúrljómunarlíftímamyndgreiningarsmásjá (FLIM) í bráðum heilasneiðum 7 vikna gamalla Mfn2cKO eða samanburðarunga til að greina hugsanlegar breytingar á oxunar-afoxunarstöðu umfrymis eftir að hafa staðfest FLIM-skilyrði (Mynd S8, E til G). Greiningin sýndi marktæka aukningu á oxunarástandi einstakra Mfn2cKO PN sem skortir PCx-tjáningu, sem er frábrugðið samanburðartaugafrumum eða Mfn2cKO PN sem tjá aðeins ruglað shRNA (Mynd 5, D og E). Þegar PCx ​​tjáning var niðurstýrð, jókst hlutfall Mfn2cKO PN sem sýndu mjög oxað ástand um meira en þrefalt (mynd 5E), sem bendir til þess að PCx uppstýring viðhélt oxunar-afoxunargetu úrkynjaðra taugafrumna.
(A) Skýringarmynd sem sýnir tilraunaáætlun fyrir inndælingu á AAV sem kóðar fyrir shPCx þegar tilgreind efnaskiptaleið er virkjuð. (B) Dæmigerðar confocal ljósmyndir af 8 vikna gömlum litlaheilasneiðum í Mfn2cKO músum sem höfðu verið erfðabreyttar og merktar með anti-calcineurin mótefni eftir 4 vikur. Kvarðastika, 450μm. (C) Magnbundin ákvörðun á Purkinje frumufrumnaþéttleika í AAV-erfðum lykkjum (einhliða dreifingargreining; n = 3 til 4 mýs). Gögn eru gefin upp sem meðaltal ± SEM; ***P < 0,001. (D) Dæmigerð FLIM mynd sýnir meðallíftíma 7 vikna gamals PN sem tjáir glútaþíón redox skynjara Grx1-roGFP2 við tilgreindar tilraunaaðstæður. LUT (uppflettitöflu) hlutfall: lifunartími (í píkósekúndum). Kvarðastika, 25μm. (E) Súluritið sýnir dreifingu Grx1-roGFP2 líftímagilda frá (D) (n=158 til 368 frumur í tveimur músum við hvora aðstæður). Skífuritið fyrir ofan hvert súlurit sýnir fjölda frumna með marktækt lengri (rauð, oxuð) eða styttri (blá, minnkað) líftímagildi, sem eru meiri en 1 staðalfrávik af meðallíftímagildi í CTRL-AAV-scr. (F) Fyrirhugaða líkanið sýnir verndandi áhrif uppstýringar á taugafrumu PCx.
Í heildina sýna gögnin sem við birtum hér að endurtjáning MFN2 getur að fullu bjargað langt gengnum æðakölkunarfrumum með alvarlegum OXPHOS skorti, alvarlegri mtDNA fækkun og afar óeðlilegri ista-líkri formgerð, og þannig tryggt samfellda framfarir jafnvel í langt gengnum sjúkdómum. Taugahrörnun veitir afturkræfar vísbendingar um stig frumudauða. Þessi sveigjanleiki í efnaskiptum er enn frekar undirstrikaður af getu taugafrumna til að örva æðakölkun (endurröðun TCA hringrásarinnar), sem hamlar PCx ​​tjáningu í æðakölkunarfrumum sem skortir OXPHOS og eykur frumudauða, og gegnir þannig verndandi hlutverki (Mynd 5F).
Í þessari rannsókn lögðum við fram vísbendingar um að viðbrögð taugafrumum (PNs) við OXPHOS-truflunum eru að stefna smám saman að æðakölkun í TCA-hringrásinni í gegnum mismunandi virkjunarleið sem virkjast af efnaskiptaferlum. Við staðfestum próteómgreininguna með mörgum viðbótaraðferðum og sýndum að þegar taugafrumur verða fyrir alvarlegri truflun á hvatberum hafa þær áður óþekkta tegund af efnaskiptateygjanleika. Okkur til undrunar markar allt endurrafmagnsferlið ekki endilega loka efnaskiptaástand sem fylgir smám saman og óafturkræft taugahrörnun, en gögn okkar benda til þess að það geti verið viðhalds taugafruma jafnvel á stigi fyrir frumudauða. Virknibætur. Þessi niðurstaða bendir til þess að taugafrumur hafi töluvert magn af efnaskiptateygjanleika í líkamanum. Þessi staðreynd sannar að síðari endurinnleiðing MFN2 getur snúið við tjáningu lykilefnaskiptamerkja og komið í veg fyrir hrörnun PN. Þvert á móti hamlar það æðakölkun og flýtir fyrir starfsemi transsexual tauga.
Ein af áhugaverðustu niðurstöðum rannsókna okkar er að taugafrumur sem skortir OXPHOS geta breytt efnaskiptum TCA hringrásarinnar með því að uppstýra ensímum sem örva sérstaklega æðakölkun. Endurröðun efnaskipta er algengt einkenni krabbameinsfrumna, en sumar þeirra reiða sig á glútamín til að bæta við milliefni TCA hringrásarinnar til að framleiða afoxandi jafngildi, sem knýja öndunarkeðjuna og viðhalda framleiðslu á forverum lípíða og núkleótíðmyndunar (39, 40). Nýleg rannsókn sýndi að í útlægum vefjum sem upplifa truflun á OXPHOS er endurtenging glútamíns/glútamat efnaskipta einnig áberandi einkenni (5, 41), þar sem stefna glútamíns inn í TCA hringrásina fer eftir alvarleika OXPHOS skaða (41). Hins vegar vantar skýrar sannanir fyrir líkindum í taugaefnaskipta sveigjanleika í líkamanum og mögulegri þýðingu þess í sjúkdómssamhengi. Í nýlegri in vitro rannsókn sýndu frumberkifrumur að virkja glútamatforða til taugaboða og stuðla þannig að oxunarefnaskiptum og æðakölkun við efnaskiptaálag (42). Það er vert að taka fram að undir lyfjafræðilegri hömlun TCA hringrásarensímsins súksínat dehýdrógenasa er talið að pýrúvatkarboxýlering viðheldur myndun oxalóasetats í ræktuðum taugafrumum í litla heilanum (34). Hins vegar hefur lífeðlisfræðileg þýðing þessara ferla fyrir heilavef (þar sem talið er að æðakölkun sé aðallega bundin við stjörnufrumur) enn mikilvæga lífeðlisfræðilega þýðingu (43). Í þessu tilviki sýna gögn okkar að taugaboðefni sem skemmast af OXPHOS í líkamanum geta skipt yfir í BCAA niðurbrot og pýrúvatkarboxýleringu, sem eru tvær helstu uppsprettur viðbótar TCA safns milliefna. Þó að hugsanlegt framlag BCAA niðurbrots til orkuefnaskipta taugafruma hafi verið lagt til, auk hlutverks glútamats og GABA fyrir taugaboð (44), eru enn engar sannanir fyrir þessum ferlum in vivo. Þess vegna er auðvelt að álykta að óeðlileg taugaboðefni geti sjálfkrafa bætt upp fyrir neyslu TCA milliefna sem knúin eru áfram af aðlögunarferlinu með því að auka æðakölkun. Sérstaklega gæti uppstjórnun á PCx verið nauðsynleg til að viðhalda aukinni eftirspurn eftir asparssýru, sem bendir til í frumum í fjölgun með truflun á hvatberum (45). Hins vegar leiddi efnaskiptagreining okkar ekki í ljós neinar marktækar breytingar á jafnvægisþéttni asparssýru í Mfn2cKO PNs (Mynd S6A), sem líklega endurspeglar mismunandi efnaskiptanýtingu asparssýru milli frumna í fjölgun og taugafrumna eftir mítósu. Þó að nákvæmur verkunarháttur PCx ​​uppstjórnunar í vanvirkum taugafrumum in vivo sé enn óljós, sýndum við fram á að þessi ótímabæra svörun gegnir mikilvægu hlutverki í að viðhalda oxunar-afoxunarástandi taugafrumna, sem sýnt var fram á í FLIM tilraunum á litilsneiðum. Sérstaklega getur það að koma í veg fyrir að PNs uppstýri PCx leitt til oxaðra ástands og hraðað frumudauða. Virkjun BCAA niðurbrots og karboxýlering pýrúvats eru ekki leiðir til að lýsa útlægum vefjum með truflun á hvatberum (7). Þess vegna virðast þær vera forgangseiginleiki OXPHOS-skorts taugafrumna, jafnvel þótt þær séu ekki eini eiginleikinn, sem er mikilvægur fyrir taugahrörnun.
Heilaheilasjúkdómur er ólíkgerð taugahrörnunarsjúkdóms sem birtist venjulega sem hreyfitruflanir og skemmir oft æðakerfi (PN) (46). Þessi taugafrumuhópur er sérstaklega viðkvæmur fyrir truflunum á hvatberum vegna þess að sértæk hrörnun þeirra í músum er nægjanleg til að endurskapa mörg af þeim hreyfieinkennum sem einkenna hryggjarliðahreyfingu hjá mönnum (16, 47, 48). Samkvæmt skýrslum er erfðabreyttur músarlíkan með stökkbreyttu geni tengt hryggjarliðahreyfingu hjá mönnum og hefur truflun á hvatberum (49, 50), sem undirstrikar mikilvægi þess að rannsaka afleiðingar OXPHOS skorts í PNPH. Þess vegna er það sérstaklega hentugt að einangra og rannsaka þennan einstaka taugafrumuhóp á áhrifaríkan hátt. Hins vegar, þar sem PN eru mjög viðkvæmir fyrir þrýstingi og eru lágt hlutfall af öllum frumuhópnum í litla heilanum, er sértæk aðskilnaður þeirra sem heilra frumna enn krefjandi þáttur fyrir margar rannsóknir sem byggja á omics. Þó að það sé nánast ómögulegt að ná algjörri mengunarleysi í öðrum frumugerðum (sérstaklega vefjum fullorðinna), sameindum við árangursríkt sundrunarskref með FACS til að fá nægilegan fjölda lífvænlegra taugafrumna fyrir próteómgreiningu eftir niðurstreymi og hafa frekar mikla próteinþekju (um 3000 prótein) samanborið við núverandi gagnasafn alls litla heilans (51). Með því að varðveita lífvænleika heilla frumna gerir aðferðin sem við bjóðum hér okkur ekki aðeins kleift að athuga breytingar á efnaskiptaferlum í hvatberunum, heldur einnig að athuga breytingar á umfrymislíkum þeirra, sem bætir við notkun hvatberahimnumerkja til að auðga frumugerð. Nýja aðferðin fyrir fjölda hvatbera í flóknum vefjum (52, 53). Aðferðin sem við lýsum tengist ekki aðeins rannsóknum á Purkinje-frumum, heldur er auðvelt að beita henni á hvaða frumugerð sem er til að takast á við efnaskiptabreytingar í sjúkum heila, þar á meðal aðrar gerðir af hvatberatruflunum.
Að lokum höfum við bent á meðferðarglugga í þessu efnaskiptaendurskipulagningarferli sem getur snúið við lykileinkennum frumuálags að fullu og komið í veg fyrir taugahrörnun. Því gæti skilningur á virkni þeirrar endurskipulagningar sem hér er lýst veitt grundvallarinnsýn í mögulegar meðferðir til að viðhalda lífvænleika taugafrumna við truflun á starfsemi hvatbera. Nauðsynlegt er að rannsaka frekar breytingar á orkuefnaskiptum í öðrum frumugerðum heilans til að sýna að fullu fram á notagildi þessarar meginreglu við aðra taugasjúkdóma.
MitoPark músum hefur verið lýst áður (31). C57BL/6N mýs með loxP-flankandi Mfn2 genum hafa verið lýst áður (18) og þær krossaðar við L7-Cre mýs (23). Tvöföldu arfblendnu afkvæmin sem mynduðust voru síðan krossuð við arfhreina Mfn2loxP/Mfn2loxP mýs til að mynda Purkinje-sértæk genarútslátt fyrir Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Í undirhópi pörunar var Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP samsætan (stop-mtYFP) kynnt til sögunnar með viðbótar krossun (20). Allar dýratilraunir voru framkvæmdar í samræmi við evrópskar, innlendar og stofnanalegar leiðbeiningar og samþykktar af LandesamtfürNatur of Umwelt and Verbraucherschutz, Norðurrín-Vestfalíu, Þýskalandi. Dýratilraunir fylgja einnig leiðbeiningum Evrópusambands tilraunadýravísindafélaga.
Eftir að hálsliðsúrliðun barnshafandi konunnar hafði verið svæfð er músarfóstrið einangrað (E13). Börkurinn var krufinn í Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) bætt við 10 mM Hepes og settur í Dulbecco's Modified Eagle's Medium sem innihélt papain (20 U/ml) og cystein (1μg/ml). Vefurinn er ræktaður í DMEM) og aðskilinn með ensímmeltingu. Ml) við 37°C í 20 mínútur og síðan malaður vélrænt í DMEM bætt við 10% fósturkúasermi. Frumurnar voru sáðar á glerþekjur húðaðar með pólýlýsíni við þéttleika 2×106 á 6 cm ræktunarskál eða við þéttleika 0,5×105 frumur/cm2 fyrir myndgreiningu. Eftir 4 klukkustundir var miðillinn skipt út fyrir Neurobasal sermisfrían miðil sem innihélt 1% B27 viðbót og 0,5 mM GlutaMax. Taugafrumunum var síðan haldið við 37°C og 5% CO2 allan tímann sem tilraunin stóð yfir og þær gefnar einu sinni í viku. Til að örva endurröðun in vitro voru 3 μl (ræktunarskál með 24 holum) eða 0,5 μl (plata með 24 holum) af eftirfarandi AAV9 veiruvektor notaðir til að meðhöndla taugafrumur á öðrum degi in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, vörunúmer 105530-AAV9) og AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, vörunúmer 105545-AAV9).
Mfn1 og Mfn2 viðbótar DNA úr músum (fengið úr Addgene plasmíði #23212 og #23213, talið í sömu röð) eru merkt með V5 röðinni (GKPIPNPLLGLDST) á C-enda og eru sameinuð mCherry í ramma í gegnum T2A röðina. Grx1-roGFP2 er gjöf frá Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Með því að skipta út tdTomato spjaldinu með hefðbundnum klónunaraðferðum var spjaldið undirklónað í pAAV-CAG-FLEX-tdTomato burðarásina (Addgene tilvísunarnúmer 28306) til að mynda pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 og pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 vektorana. Svipuð aðferð var notuð til að búa til stjórnunarvigurinn pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Til að búa til AAV-shPCx smygildið þarf plasmíð AAV vigur (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), sem inniheldur DNA raðina sem kóðar fyrir shRNA sem miðar á músar PCx ​​(5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCAAAG 3′). Undir stjórn U6 hvata er notað mCherry undir stjórn CMV hvata. Framleiðsla á hjálpar AAV vigurum var framkvæmd samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda (Cell Biolabs). Í stuttu máli skal nota flutningsplasmíð sem ber tímabundið mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry). Transfection á 293AAV frumum-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) eða Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) kóðunargeni, sem og kóðun á AAV1 kapsíðpróteini og aukapróteini. Pökkun plasmíðs plasmíðs, með kalsíumfosfat aðferð. Óhreinsaða veiruyfirborðið var fengið með frystingar-þíðingarlotum í þurrís/etanólbaði og frumur leystar upp í fosfatlausn (PBS). AAV vektorinn var hreinsaður með ósamfelldri joðixanól stigulsöfgunarskilvindu (24 klukkustundir við 32.000 snúninga á mínútu og 4°C) og þéttur með Amicon ultra-15 skilvindusíu. Erfðamengistítra AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9×1013 erfðamengisafrit (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX var eins og áður hefur verið lýst (54), mælt með rauntíma megindlegri PCR (qPCR) -MFN1-V5 (1,9×1013 GC/ml) og AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9×1012 GC/ml).
Frumfrumur voru skafaðar af í ísköldu 1x PBS, settar í köggla og síðan gerðar einsleitar í 0,5% Triton X-100 / 0,5% natríumdeoxýkólat/PBS lýsislausn sem innihélt fosfatasa og próteasahemil (Roche). Próteinmagnsgreining var framkvæmd með því að nota bísínkónínsýrupróf (Thermo Fisher Scientific). Próteinin voru síðan aðskilin með SDS-pólýakrýlamíð gel rafdrátt og síðan sett á pólývínýlidenflúoríð himnu (GE Healthcare). Ósértæk svæði voru lokuð og ræktuð með frummótefninu (sjá töflu S1 fyrir nánari upplýsingar) í 5% mjólk í TBST (Tris-stuðpúðuð saltlausn með Tween), þvottastref og aukamótefni í TBST Incubate. Ræktað með frummótefninu yfir nótt við +4°C. Eftir þvott, berið aukamótefnið á í 2 klukkustundir við stofuhita. Síðan, með því að rækta sama blettinn með anti-β-aktín mótefni, var sama hleðsla staðfest. Greining með því að umbreyta í efnaljómun og auka efnaljómun (GE Healthcare).
Taugafrumurnar sem áður höfðu verið sáðar á glerþekjugler voru festar með 4% paraformaldehýði (PFA)/PBS á tilgreindum tímapunkti við stofuhita í 10 mínútur. Þekjuglerin eru fyrst gegndreypt með 0,1% Triton X-100/PBS í 5 mínútur við stofuhita og síðan í blokkunarlausn [3% nautgripasermisalbúmín (BSA)/PBS]. Á öðrum degi voru þekjuglerin þvegin með blokkunarlausn og ræktuð með viðeigandi flúorófor-tengdu aukamótefni í 2 klukkustundir við stofuhita; að lokum voru sýnin þvegin vandlega í PBS með 4′,6-díamídínó-2-fenýlindóli (DAPI), mótlituð og síðan fest á smásjárgler með Aqua-Poly/Mount.
Mýs (karlkyns og kvenkyns) voru svæfðar með inndælingu ketamíns (130 mg/kg) og xýlazíns (10 mg/kg) í kviðarhol og gefin undir húð karprófen verkjalyf (5 mg/kg). Þær voru settar í stereotaktískt tæki (Kopf) með hlýjum púða. Hauskúpan er opnuð og tannborvél er notuð til að þynna þann hluta litla heilaberkisins sem samsvarar mis beininu (frá lambda: hali 1,8, hliðlægur 1, sem samsvarar IV og V lobulum). Notið sveigða sprautunál til að búa varlega til lítið gat í höfuðkúpunni til að forðast að raska æðakerfinu fyrir neðan. Síðan er þunnt dregið glerháræðakerfi hægt sett inn í örgatið (frá -1,3 til -1 á kviðarhlið dura mater) og 200 til 300 nl AAV er sprautað inn í örsprautuna (Narishige) með handsprautum (Narishige) nokkrum sinnum við lágan þrýsting yfir 10 til 20 mínútna glugga. Eftir innrennslið skal setja háræðarnar í 10 mínútur í viðbót til að leyfa veirunni að dreifa sér að fullu. Eftir að háræðarnar hafa verið fjarlægðar er húðin saumuð vandlega til að lágmarka sárbólgu og leyfa dýrinu að jafna sig. Dýrin voru meðhöndluð með verkjalyfjum (caspofen) í nokkra daga eftir aðgerðina, á meðan var fylgst vandlega með líkamlegu ástandi þeirra og síðan voru þau aflífuð á tilgreindum tímapunkti. Allar aðgerðir voru framkvæmdar í samræmi við evrópskar, innlendar og stofnanalegar leiðbeiningar og voru samþykktar af LandesamtfürNatur of Umwelt and Verbraucherschutz, Norðurrín-Vestfalía, Þýskalandi.
Dýrin voru svæfð með ketamíni (100 mg/kg) og xýlazíni (10 mg/kg) og hjartað var fyrst gegndreypt með 0,1 M PBS og síðan með 4% PFA í PBS. Vefurinn var krufinn og festur í 4% PFA/PBS yfir nótt við 4°C. Titrandi hnífur (Leica Microsystems GmbH, Vín, Austurríki) var notaður til að útbúa miðlínusneiðar (50 μm þykkar) úr festum heila í PBS. Nema annað sé tekið fram var litun á frífljótandi sneiðum framkvæmd eins og lýst er hér að ofan (13) við stofuhita og hrært. Í stuttu máli voru sneiðarnar sem fengust fyrst gegndræpar með 0,5% Triton X-100/PBS í 15 mínútur við stofuhita; fyrir suma mótefnavaka (Pcx og Shmt2), með því að setja sneiðarnar í tris-EDTA stuðpúða við 80°C (pH 9) í 25 mínútur í stað þessa skrefs. Næst voru sneiðarnar ræktaðar með aðalmótefni (sjá töflu S1) í blokkunarlausn (3% BSA/PBS) við 4°C yfir nótt og hrært var í. Daginn eftir voru sneiðarnar þvegnar með blokkunarlausn og ræktaðar með viðeigandi flúorófór-tengdu aukamótefni í 2 klukkustundir við stofuhita; að lokum voru sneiðarnar þvegnar vandlega í PBS, mótlitaðar með DAPI og síðan festar með AquaPolymount á smásjárgler.
Notað var leysigeislaskönnunar-samfókussmásjá (TCS SP8-X eða TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) búin hvítum ljósleysi og 405 díóðu útfjólubláum leysi til að mynda sýnið. Með því að örva flúrljómunarleiðarann ​​og safna merkinu með Hybrid Detector (HyDs) var LAS-X hugbúnaður notaður til að safna staflaðar myndir í samræmi við Nyquist sýnatöku í raðbundinni stillingu: fyrir ómagnbundnar spjöld eru það mjög kraftmikil merki (til dæmis í líkamsfrumum og dendrítum) (mtYFP). Notið HyD til að greina fjölda PN í BrightR stillingu). Hliðrun frá 0,3 til 6 ns er beitt til að draga úr bakgrunni.
Rauntímamyndgreining á flokkuðum frumum. Eftir flokkun í Neurobasal-A miðli sem innihélt 1% B27 viðbót og 0,5 mM GlutaMax, voru frumurnar strax sáðar á pólý-l-lýsín-húðaðar glerskifur (μ-Slide8 Well, Ibidi, vörunúmer 80826) og síðan geymdar við 37°C og 5% CO2 í 1 klukkustund til að leyfa frumunum að setjast. Rauntímamyndgreining var framkvæmd á Leica SP8 leysigeislaskönnunar-samfókussmásjá búinn hvítum leysi, HyD, 63×[1,4 tölulegu ljósopi (NA)] olíulinsu og hitunarpalli.
Músin var fljótt svæfð með koltvísýringi og hálshöggvin, heilinn var fljótt fjarlægður úr höfuðkúpunni og skorinn í 200 μm þykkar (fyrir 13C merkingartilraun) eða 275 μm þykkar (fyrir tvær ljóseindatilraunir) miðlínusneiðar fylltar með eftirfarandi efnum. Ískremið (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Þýskalandi) er fyllt með eftirfarandi efnum: 125 mM ísköld, kolefnismettuð (95% O2 og 5% CO2) lág Ca2 + gervi heila- og mænuvökva (ACSF) NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natríumfosfat stuðpúði, 25 mM NaHCO3, 25 mM glúkósa, 0,5 mM CaCl2 og 3,5 mM MgCl2 (osmósuþrýstingur 310 til 330 mmól). Flytjið heilasneiðarnar sem fengust í forræktunarklefa sem inniheldur hærra Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natríumfosfat stuðpúði, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glúkósa, 1,0 mM CaCl2 og 2,0 mM MgCl2) miðil) pH 7,4 og 310 til 320 mmól).
Meðan á myndgreiningarferlinu stóð voru sneiðarnar færðar í sérstakt myndgreiningarherbergi og tilraunin var framkvæmd undir stöðugri ACSF blóðflæði við stöðugt hitastig á bilinu 32° til 33°C. Fjölfótóna leysigeislaskönnunarsmásjá (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) búin Leica 25x hlutlinsu (NA 0,95, vatn) og Ti:Sapphire leysir (Chameleon Vision II, Coherent) var notaður til myndgreiningar á sneiðunum. FLIM eining (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM af Grx1-roGFP2. Breytingar á oxunar-afoxunarástandi PN í umfrymi voru mældar með tveggja-fótóna FLIM í miðlínusneiðum af heila, þar sem Grx1-roGFP2 lífskynjarinn miðaði á PN. Í PN laginu er öflunarsviðið valið um 50 til 80 μm undir yfirborði sneiðarinnar til að tryggja að það sé raunhæft PN (þ.e. skortur á perlulaga uppbyggingu eða taugafrumubreytingum meðfram dendrítum) og tvöfaldur jákvæður roGFP2 skynjari og AAV kóðandi shRNA PCx eða stjórnröð þess (hvort sem það tjáir mCherry saman). Safnið einum stafla myndum með 2x stafrænni aðdráttar [örvunarbylgjulengd: 890 nm; 512 nm 512 pixlar]. Greining: innri HyD, flúoreseín ísóþíósýanat (FITC) síuhópur] og myndmeðaltal innan 2 til 3 mínútna er notað til að tryggja að nægilega margar ljóseindir séu safnaðar (1000 ljóseindir samtals) fyrir ferilaðlögun. Næmi Grx1-roGFP2 rannsakandans og staðfesting á FLIM skilyrðum var framkvæmd með því að fylgjast með líftíma roGFP2 þegar utanaðkomandi 10 mM H2O2 var bætt við gegnflæðis-ACSF (til að hámarka oxun, sem leiðir til aukins líftíma) og síðan bætt við 2 mM díþíóþreitóli (lágmarkar minnkunarstig, sem leiðir til styttingar á líftíma) (Mynd S8, D til G). Notið FLIMfit 5.1.1 hugbúnaðinn til að greina niðurstöðurnar, aðlaga staka veldisvísisrýrnun allrar myndarinnar að mældum IRF (svörunarfalli tækisins) og χ2 er um það bil 1. Til að reikna út líftíma staks PN var gríman í kringum taugabolinn teiknuð handvirkt og meðallíftími í hverri grímu var notaður til magngreiningar.
Greining á hvatberamöguleikum. Eftir að bráðasneiðin hafði verið ræktuð með 100 nM TMRM sem bætt var beint við blóðflæðis-ACSF í 30 mínútur, voru breytingar á hvatberamöguleikum PN mældar með tveggja ljóseinda smásjá. TMRM myndgreining var framkvæmd með því að örva rannsakandann við 920 nm og nota innra HyD (tetrametýlródamín ísóþíósýanat: 585/40 nm) til að safna merkjum; með því að nota sömu örvunarbylgjulengd en með því að nota annað innra HyD (FITC: 525/50) til að mynda mtYFP. Notið Image Calculator viðbótina frá ImageJ til að meta hvatberamöguleika á einstökum frumustigi. Í stuttu máli er viðbótajafnan: merki = mín (mtYFP, TMRM) notuð til að bera kennsl á hvatberasvæðið sem sýnir TMRM merkið í Purkinje Somali í einstafa confocal mynd af samsvarandi rás. Síðan er pixlaflatarmálið í grímunni sem myndast magngreint og síðan staðlað á samsvarandi þröskuldsmynd af mtYFP rásinni til að fá hlutfall hvatbera sem sýnir möguleika hvatbera.
Myndin var afmynduð með Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) hugbúnaði. Fyrir skönnuðar myndir af flísum er samsetning af einni flís gerð með sjálfvirkri saumareiknirit frá LAS-X hugbúnaðinum. Eftir myndakvarðun skal nota ImageJ og Adobe Photoshop til að vinna myndina frekar og stilla birtustig og andstæðu jafnt. Notið Adobe Illustrator til grafískrar undirbúnings.
Fókusgreining á mtDNA. Fjöldi mtDNA meinsemda var magngreindur á litlaheilasneiðum sem merktar voru með mótefnum gegn DNA með confocal smásjá. Hvert marksvæði var búið til fyrir frumubol og kjarna hverrar frumu og viðkomandi svæði var reiknað með Multi Measure viðbótinni (ImageJ hugbúnaður). Kjarnaflatarmálið er dregið frá frumubolflatarmálinu til að fá umfrymisflatarmálið. Að lokum var Analyze Particles viðbótin (ImageJ hugbúnaður) notuð til að magngreina sjálfkrafa umfrymis DNA punktana sem gefa til kynna mtDNA á þröskuldsmyndinni og niðurstöðurnar voru staðlaðar miðað við PN meðaltal CTRL músa. Niðurstöðurnar eru tjáðar sem meðalfjöldi núkleósíða í hverri frumu.
Greining á prótíntjáningu. Notið viðbótina Image Calculator frá ImageJ til að meta prótíntjáningu í PN á einstökum frumum. Í stuttu máli, í einlags samskeytismynd af samsvarandi rás, með jöfnunni: merki = mín (mtYFP, mótefni), er hvatberasvæðið sem sýnir ónæmisviðbrögð við ákveðnu mótefni í Purkina greint. Síðan er pixlasvæðið í grímunni sem myndast magnbundið og síðan staðlað á samsvarandi þröskuldsmynd af mtYFP rásinni til að fá hvatberahlutfallið af birtu prótíninu.
Þéttleikagreining á Purkinje-frumum. Viðbótin Cell Counter fyrir ImageJ var notuð til að meta Purkinje-þéttleika með því að deila fjölda taldra Purkinje-frumna með lengd litlaheilahringsins sem taldar frumur eru uppteknar af.
Undirbúningur og söfnun sýna. Heilar úr samanburðarhópnum og Mfn2cKO músum voru festir í 2% PFA/2,5% glútaraldehýð í 0,1 M fosfatlausn (PB), og síðan voru kransæðasneiðar útbúnar með því að nota bifhár (Leica Mikrosysteme GmbH, Vín, Austurríki) (þykkt 50 til 60 μm). Síðan voru sneiðarnar festar í PB-lausn í 1% os tetraoxíði og 1,5% kalíumferrósýaníði við stofuhita í 1 klukkustund. Sneiðarnar voru þvegnar þrisvar sinnum með eimuðu vatni og síðan litaðar með 70% etanóli sem innihélt 1% úranýlasetat í 20 mínútur. Sneiðarnar voru síðan þurrkaðar í flokkuðum alkóhóli og settar í Durcupan ACM (Araldite steypuefni M) epoxy plastefni (Electron Microscopy Sciences, vörulistanúmer 14040) á milli kísilhúðaðra glerskiva og að lokum við 60°C fjölliðaðar í ofni í 48 klukkustundir. Litla heilabörkurinn var valinn og 50 nm úrþunnar sneiðar skornar á Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vín, Austurríki) og valdar á 2×1 mm koparrifunarnet húðað með pólýstýrenfilmu. Sneiðarnar voru litaðar með lausn af 4% úranýlasetati í H2O í 10 mínútur, þvegnar með H2O nokkrum sinnum, síðan með Reynolds blýsítrati í H2O í 10 mínútur og síðan þvegnar með H2O nokkrum sinnum. Smásjármyndir voru teknar með rafeindasmásjá Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Bandaríkjunum) með stafrænni myndavél af gerðinni TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, Bandaríkjunum, Þýskalandi).
Fyrir mýs sem voru smitaðar af AAV var heilinn aðskilinn og skorinn í 1 mm þykkan miðlínusneið og litla heilinn skoðaður með flúrljómunarsmásjá til að bera kennsl á AAV-smitaða hringinn (þ.e. mCherry-tjáningu). Aðeins tilraunir þar sem AAV-innspýting leiðir til mjög mikillar skilvirkni í Purkinje-frumulaginu (þ.e. næstum öllu laginu) í að minnsta kosti tveimur samfelldum litlaheilahringjum eru notaðar. Lykkjan sem var umbreytt með AAV var örkönnuð til festingar yfir nótt (4% PFA og 2,5% glútaraldehýð í 0,1 M kókoatlausn) og síðan unnin áfram. Fyrir EPON-innfellingu var festi vefurinn þveginn með 0,1 M natríum kókoatlausn (Applichem) og ræktaður með 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) í 0,1 M natríum kókoatlausn (Applichem) í 4 klukkustundir og síðan þveginn í 2 klukkustundir. Endurtakið 3 sinnum með 0,1 M kókamíðlausn. Í kjölfarið var vaxandi röð etanóls notuð til að rækta hverja etanóllausn við 4°C í 15 mínútur til að þurrka vefinn. Vefurinn var færður yfir í própýlenoxíð og ræktaður yfir nótt í EPON (Sigma-Aldrich) við 4°C. Setjið vefinn í ferskt EPON við stofuhita í 2 klukkustundir og síðan stingið honum inn í 62°C í 72 klukkustundir. Notið öfgaörsneiðara (Leica Microsystems, UC6) og demantshníf (Diatome, Biel, Sviss) til að skera 70 nm öfgaþunnar sneiðar og litið með 1,5% úranýlasetati í 15 mínútur við 37°C og litið með blýsítratlausn í 4 mínútur. Rafeindasmásjármyndirnar voru teknar með JEM-2100 Plus rafeindasmásjá (JEOL) búinni Camera OneView 4K 16-bita (Gatan) og DigitalMicrograph hugbúnaði (Gatan). Til greiningar voru rafeindasmásjármyndir teknar með 5000× eða 10.000× stafrænni aðdrátt.
Formfræðileg greining á hvatberum. Í öllum greiningum voru útlínur einstakra hvatbera handvirkt teiknaðar upp á stafrænar myndir með því að nota ImageJ hugbúnað. Mismunandi formfræðilegir breytur eru greindar. Þéttleiki hvatbera er tjáður sem prósenta sem fæst með því að deila heildarflatarmáli hvatbera hverrar frumu með flatarmáli umfrymis (flatarmál umfrymis = flatarmál frumu - flatarmál frumukjarna) × 100. Rúmmyndun hvatbera er reiknuð með formúlunni [4π∙(flatarmál/ummál 2)]. Ista formgerð hvatbera var greind og skipt í tvo flokka („pípulaga“ og „blöðrulaga“) eftir aðallögun þeirra.
Greining á fjölda og þéttleika sjálfsáts/lýsósóma. Notið ImageJ hugbúnaðinn til að útlína handvirkt útlínur hvers sjálfsáts/lýsósóms á stafrænu myndinni. Flatarmál sjálfsáts/lýsósóms er táknað sem prósenta reiknuð með því að deila heildarflatarmáli sjálfsáts/lýsósómbyggingar hverrar frumu með flatarmáli umfrymis (flatarmál umfrymis = flatarmál frumu - flatarmál kjarna) × 100. Þéttleiki sjálfsáts/lýsósóma er reiknaður með því að deila heildarfjölda með fjölda sjálfsáts/lýsósómbygginga í hverri frumu (miðað við umfrymisflatarmál) (flatarmál umfrymis = flatarmál frumu - flatarmál kjarna).
Merking fyrir bráða sneiðingu og sýnisundirbúning. Fyrir tilraunir sem krefjast glúkósamerkingar skal flytja bráðu heilasneiðarnar í forræktunarklefa sem inniheldur mettað kolefni (95% O2 og 5% CO2), ACSF með háu Ca2 + innihaldi (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natríumfosfat stuðpúða, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glúkósa, 1,0 mM CaCl2 og 2,0 mM MgCl2, stillt á pH 7,4 og 310 til 320 mOsm), þar sem glúkósi er 13C6-glúkósaskipti (Eurisotop, vörulistanúmer CLM-1396). Fyrir tilraunir sem krefjast merkingar með pýrúvati, flytjið bráðu heilasneiðarnar yfir í ACSF með hærra Ca2 + (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natríumfosfatlausn, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glúkósa, 1,0 mM CaCl2 og bætið við 2,0 mM MgCl2, stillið pH 7,4 og 310 til 320 mOsm), og bætið við 1 mM 1-[1-13C]pýrúvati (Eurisotop, vörunúmer CLM-1082). Ræktið sneiðarnar í 90 mínútur við 37°C. Í lok tilraunarinnar voru sneiðarnar þvegnar fljótt með vatnslausn (pH 7,4) sem innihélt 75 mM ammóníumkarbónat og síðan jafnblandaðar í 40:40:20 (v:v:v) asetónítríli (ACN): metanóli: vatni. Eftir að sýnin höfðu verið ræktuð á ís í 30 mínútur voru þau skilvinduð við 21.000 g í 10 mínútur við 4°C og tæra ofanvökvinn þurrkaður í SpeedVac þykkni. Þurrkuðu umbrotsefnisblöðrurnar sem mynduðust voru geymdar við -80°C þar til greining fór fram.
Vökvaskiljun-massagreining á 13C-merktum amínósýrum. Fyrir vökvaskiljun-massagreiningu (LC-MS) var umbrotsefnispelletið enduruppleyst í 75μl af LC-MS gæðum vatni (Honeywell). Eftir skilvindu við 21.000 g í 5 mínútur við 4°C voru 20μl af skýrðu ofanvökvanum notaðir til greiningar á amínósýruflæði, en afgangurinn af útdrættinum var strax notaður til anjóngreiningar (sjá hér að neðan). Amínósýrugreining var framkvæmd með því að nota áður lýsta bensóýlklóríð afleiðuaðferð (55, 56). Í fyrsta skrefi voru 10μl af 100 mM natríumkarbónati (Sigma-Aldrich) bætt við 20μl af umbrotsefnisútdrætti og síðan voru 10μl af 2% bensóýlklóríði (Sigma-Aldrich) bætt við LC gæðum ACN. Sýnið var hrært í stutta stund í vortex og síðan skilvindað við 21.000 g í 5 mínútur við 20°C. Færið hreinsaða ofanfljótandi vökvann í 2 ml sjálfvirkt sýnatökuglas með keilulaga glerinnleggi (200 μl rúmmál). Sýnin voru greind með Acquity iClass ultra-high-performance LC kerfinu (Waters) sem var tengt við Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) hágæða nákvæmnismassagreini (Thermo Fisher Scientific). Til greiningar voru 2 μl af afleiðusýninu sprautað inn í 100×1,0 mm sterka kísil T3 dálk (Waters) sem innihélt 1,8 μm agnir. Flæðishraðinn er 100 μl/mín og stuðpúðakerfið samanstendur af stuðpúða A (10 mM ammóníumformat og 0,15% maurasýra í vatni) og stuðpúða B (ACN). Hallinn er sem hér segir: 0%B við 0 mínútur; 0%B. 0 til 15% B eftir 0 til 0,1 mínútu; 15 til 17% B eftir 0,1 til 0,5 mínútur; B eftir 17 til 55% eftir 0,5 til 14 mínútur; B eftir 55 til 70% eftir 14 til 14,5 mínútur; eftir 14,5 til 70 til 100% B eftir 18 mínútur; 100% B eftir 18 til 19 mínútur; 100 til 0% B eftir 19 til 19,1 mínútur; 0% B eftir 19,1 til 28 mínútur (55, 56). QE-HF massagreinirinn starfar í jákvæðri jónunarham með massabili m/z (massa/hleðsluhlutfall) frá 50 til 750. Notuð upplausn er 60.000, og jónamarkmiðið með magnstýringu (AGC) sem fæst er 3×106, og hámarks jónatími er 100 millisekúndur. Hitaða rafúðajónunargjafinn (ESI) starfar við úðaspennu upp á 3,5 kV, háræðahita upp á 250°C, slíðurloftstreymi upp á 60 AU (handahófskenndar einingar) og aukaloftstreymi upp á 20 AU til 250°C. S-linsan er stillt á 60 AU.
Anjónaskiljun-MS greining á 13C-merktum lífrænum sýrum. Eftirstandandi útfelling úr umbrotsefninu (55 μl) var greind með Dionex jónskiljunarkerfi (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) tengt QE-HF massagreini (Thermo Fisher Scientific). Í stuttu máli voru 5 μl af umbrotsefnisútdrætti sprautað inn í Dionex IonPac AS11-HC dálk sem var búinn HPLC (2 mm × 250 mm, agnastærð 4 μm, Thermo Fisher Scientific) í innskotsham með fyllingarhlutfalli 1. Dionex IonPac AG11-HC varnarsúla (2 mm x 50 mm, 4 μm, Thermo Fisher Scientific). Hitastig dálksins er haldið við 30°C og sjálfvirki sýnatökubúnaðurinn er stilltur á 6°C. Notið kalíumhýdroxíðhylki með afjónuðu vatni til að mynda kalíumhýdroxíðhalla í gegnum útskiljunarvökvann. Aðskilnaður umbrotsefna við rennslishraða 380 μl/mín. með eftirfarandi stigulsbreytingu: 0 til 3 mínútur, 10 mM KOH; 3 til 12 mínútur, 10 til 50 mM KOH; 12 til 19 mínútur, 50 til 100 mM KOH; 19 til 21 mínúta, 100 mM KOH; 21 til 21,5 mínútur, 100 til 10 mM KOH. Súlan var endurjafnvægd við 10 mM KOH í 8,5 mínútur.
Útskoluðu umbrotsefnin eru sameinuð 150 μl/mín. af ísóprópanóli eftir súluna og síðan beint að hágæða massagreini sem starfar í neikvæðri jónunarham. Massagreiningin fylgist með massabilinu frá m/z 50 til 750 með 60.000 upplausn. AGC er stillt á 1×106 og hámarksjónartími er haldið við 100 ms. Hitaða ESI-lindin var starfrækt við úðaspennu upp á 3,5 kV. Aðrar stillingar jónalindarinnar eru sem hér segir: háræðahitastig 275°C; slíðurgasflæði, 60 AU; hjálpargasflæði, 20 AU við 300°C og S-linsa stillt á 60 AU.
Gagnagreining á 13C merktum umbrotsefnum. Notið TraceFinder hugbúnað (útgáfa 4.2, Thermo Fisher Scientific) til að greina gagnahlutfall samsæta. Auðkenni hvers efnasambands var staðfest með áreiðanlegu viðmiðunarefnasambandi og greint sjálfstætt. Til að framkvæma samsætuauðgunargreiningu var flatarmál útdregins jónaskiljunar (XIC) hvers 13C samsætis (Mn) dregið út úr [M + H]+, þar sem n er kolefnistala markefnasambandsins, sem notað er til að greina amínósýrur eða [MH]+ er notað til að greina anjónir. Massa nákvæmni XIC er minni en fimm hlutar á milljón og nákvæmni RT er 0,05 mínútur. Auðgunargreiningin er framkvæmd með því að reikna hlutfall hvers greindra samsætis af summu allra samsæta samsvarandi efnasambands. Þessi hlutföll eru gefin sem prósentugildi fyrir hverja samsætu og niðurstöðurnar eru tjáðar sem mólarprósentu auðgun (MPE), eins og áður hefur verið lýst (42).
Frysta taugafrumukúlan var gerð einsleit í ísköldu 80% metanóli (v/v), hrist í vortex og ræktuð við -20°C í 30 mínútur. Hristið sýnið aftur í vortex og hrærið við +4°C í 30 mínútur. Sýnið var skilvindað við 21.000 g í 5 mínútur við 4°C og síðan var ofanvökvinn safnað og þurrkaður með SpeedVac þykkni við 25°C til síðari greiningar. Eins og lýst er hér að ofan var LC-MS greining framkvæmd á amínósýrum flokkaðra frumna. Með því að nota TraceFinder (útgáfa 4.2, Thermo Fisher Scientific) var gagnagreining framkvæmd með því að nota einþátta massa hvers efnasambands. Magnbundin staðlun umbrotsefnagagna var framkvæmd með því að nota preprocessCore hugbúnaðarpakkann (57).
Undirbúningur sneiðar. Músin var svæfð fljótt með koltvísýringi og hálshöggvinn, heilinn var fljótt fjarlægður úr höfuðkúpunni og ísfylltur titrandi hnífur (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Þýskalandi) var notaður til að skera hana í 300 til 375 μm miðlínusneiðar. Köld kolefnisgösun (95% O2 og 5% CO2) Lítið Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natríumfosfat stuðpúði, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glúkósi, 1,0 mM CaCl2 og 6,0 mM MgCl2. Stillt á pH 7,4 og 310 til 330 mOsm). Færið heilasneiðarnar sem fengust í hólf sem inniheldur hærra Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natríumfosfatlausn, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glúkósa, 4,0 mM CaCl2 og mM 3,5 MgCl2) pH 7,4 og 310 til 320 mOsm). Geymið sneiðarnar í 20 til 30 mínútur svo hægt sé að endurheimta þær áður en þær eru teknar upp.
Upptaka. Smásjárpallur með föstum upptökuklefa og 20x vatnsdýfingarlinsu (Scientifica) var notaður fyrir allar upptökur. Hugsanlegar Purkinje frumur voru greindar út frá (i) líkamsstærð, (ii) staðsetningu litla heilans í líffærafræði og (iii) tjáningu á flúrljómandi mtYFP vísigeninu. Pípettan með oddiviðnám upp á 5 til 11 megohm er dregin út með háræðarpípettu úr bórsílíkatgleri (GB150-10, 0,86 mm × 1,5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Þýskalandi) og láréttri pípettu frá Instruments (P-1000, Sutter), Novato, Kaliforníu). Allar upptökur voru framkvæmdar með ELC-03XS npi plásturklemmumagnara (npi electronic GmbH, Tam, Þýskalandi), sem var stjórnað af hugbúnaðinum Signal (útgáfa 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, Bretlandi). Tilraunin var tekin upp með sýnatökutíðni 12,5 kHz. Merkið er síað með tveimur stutttíðnis Bessel-síum með afmörkunartíðni 1,3 og 10 kHz, talið í sömu röð. Rýmd himnunnar og pípettunnar er jafnað með jöfnunarrás með magnaranum. Allar tilraunir voru framkvæmdar undir stjórn Orca-Flash 4.0 myndavélar (Hamamatsu, Gerden, Þýskalandi), sem var stjórnað af Hokawo hugbúnaðinum (útgáfa 2.8, Hamamatsu, Gerden, Þýskalandi).
Venjuleg uppsetning og greining á heilum frumum. Strax fyrir skráningu skal fylla pípettuna með innri lausninni sem inniheldur eftirfarandi efni: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM kalíumglúkonat, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (Mg), 0,5 mM gúanósíntrífosfat (GTP) (Na) og 10,0 mM kreatínínfosfat voru stillt á pH 7,25 og osmósuþrýstingurinn var 290 mOsm (súkrósi). Strax eftir að 0 pA krafti var beitt til að sprengja himnuna var hvíldarhimnuspennan mæld. Inntaksviðnámið er mælt með því að beita ofskautuðum straumum upp á -40, -30, -20 og -10 pA. Mælið stærð spennusvörunarinnar og notið lögmál Ohms til að reikna inntaksviðnámið. Sjálfsprottin virkni var skráð í spennuklefa í 5 mínútur og sPSC var greint og mælt í Igor Pro (útgáfa 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, Bandaríkjunum) með því að nota hálfsjálfvirkt greiningarforrit. IV-kúrvan og stöðugur straumur eru mæld með því að klemma rafhlöðuna við mismunandi spennur (byrjar frá -110 mV) og auka spennuna í 5 mV skrefum. Framleiðsla AP var prófuð með því að beita afskautunarstraumi. Klemmið rafhlöðuna við -70 mV á meðan afskautunarstraumspúls er beitt. Stillið skrefastærð hverrar upptökueiningar fyrir sig (10 til 60 pA). Reiknið hámarks AP-tíðni með því að telja handvirkt púlstoppana sem valda hæstu AP-tíðninni. AP-þröskuldurinn er greindur með því að nota aðra afleiðu afskautunarpúlsins sem fyrst kveikir á einum eða fleiri AP-einingum.
Uppsetning og greining á götuðum plástrum. Framkvæmið götuð plástursskráningu samkvæmt stöðluðum aðferðum. Notið ATP- og GTP-lausa pípettu sem inniheldur ekki eftirfarandi innihaldsefni: 128 mM glúkónat K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EGTA og 2 mM MgCl2, og stillið á pH 7,2 (með KOH). ATP og GTP eru sleppt úr innanfrumulausninni til að koma í veg fyrir stjórnlausa gegndræpi frumuhimnunnar. Plásturspípettan er fyllt með innri lausn sem inniheldur amfóterísín (u.þ.b. 200 til 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) til að fá götuð plástursskráningu. Amfóterísín var leyst upp í dímetýlsúlfoxíði (lokastyrkur: 0,1 til 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Styrkur DMSO sem notaður var hafði engin marktæk áhrif á taugafrumurnar sem rannsakaðar voru. Meðan á gata stóð var rásarviðnámið (Ra) stöðugt fylgst með og tilraunin hófst eftir að sveifluvídd Ra og AP hafði náð stöðugleika (20-40 mínútur). Sjálfsprottin virkni er mæld í spennu- og/eða straumklemma í 2 til 5 mínútur. Gagnagreining var framkvæmd með Igor Pro (útgáfa 7.05.2, WaveMetrics, Bandaríkin), Excel (útgáfa 2010, Microsoft Corporation, Redmond, Bandaríkin) og GraphPad Prism (útgáfa 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, Kaliforníu). Bandaríkin. Til að bera kennsl á sjálfsprottna AP er notað NeuroMatic v3.0c viðbótin frá IgorPro. AP eru sjálfkrafa borin kennsl á með því að nota tiltekið þröskuld, sem er stillt fyrir hverja færslu fyrir sig. Með því að nota toppbilið er ákvarðað topptíðni með hámarks augnablikstopptíðni og meðaltoppatíðni.
Einangrun papaína. Með því að aðlagast áður birtri aðferð var papaína hreinsað úr litli heila músa á ákveðnu stigi (58). Í stuttu máli var litli heilinn krufinn og saxaður í ísköldu sundrunarmiðli [án HBSS Ca2+ og Mg2+, bætt við 20 mM glúkósa, penisillíni (50 U/ml) og streptómýsíni (0,05 mg/ml)], og síðan melt miðilinn í papaíni [HBSS, bætt við 1-cystein·HCl (1 mg/ml), papaíni (16 U/ml) og deoxýríbónúkleasa I (DNasa I; 0,1 mg/ml)]. Meðhöndlað í 30 mínútur við 30°C. Fyrst skal þvo vefina í HBSS-miðli sem inniheldur eggjaslím (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) og DNasa (0,1 mg/ml) við stofuhita til að koma í veg fyrir ensímmeltingu, og síðan í HBSS-miðlinum sem inniheldur 20 mM glúkósa. Malið varlega í HBSS, penisillín (50 U/ml), streptómýsín (0,05 mg/ml) og DNasa (0,1 mg/ml) einstakar frumur. Frumusviflausnin sem myndaðist var síuð í gegnum 70 μm frumusigti, síðan voru frumurnar settar í skilvindu (1110 snúningar á mínútu, 5 mínútur, 4°C) og enduruppleystar í flokkunarmiðli [HBSS, bætt við 20 mM glúkósa, 20% fósturkúpasermi, penisillín (50 U/ml) og streptómýsín (0,05 mg/ml)]; metið frumulifun með própídíumjoði og stillið frumuþéttleikann á 1×106 til 2×106 frumur/ml. Áður en flæðifrumumælingar voru gerðar var sviflausnin síuð í gegnum 50 μm frumusigti.
Flæðifrumumælir. Frumuflokkun var framkvæmd við 4°C með FACSAria III tæki (BD Biosciences) og FACSDiva hugbúnaði (BD Biosciences, útgáfa 8.0.1). Frumusviflausnin var flokkuð með 100 μm stút undir þrýstingi upp á 20 psi á hraðanum ~2800 atburðir/sek. Þar sem hefðbundin lykkjuviðmið (frumustærð, tvíþátta aðgreining og dreifingareiginleikar) geta ekki tryggt rétta einangrun PN frá öðrum frumugerðum, er lykkjustefnan ákvörðuð út frá beinum samanburði á YFP styrkleika og sjálfflúrljómun í mitoYFP+ ​​og samanburðar mitoYFP − músum. YFP er örvað með því að geisla sýninu með 488 nm leysigeislalínu og merkið er greint með 530/30 nm bandpass filter. Í mitoYFP+ ​​músum er hlutfallslegur styrkur Rosa26-mitoYFP fréttargensins einnig notaður til að greina á milli taugahluta og taugasímabrota. 7-AAD er örvað með 561 nm gulum leysigeisla og greint með 675/20 nm bandpass filter til að útiloka dauðar frumur. Til að aðskilja stjörnufrumur á sama tíma var frumusviflausnin lituð með ACSA-2-APC, síðan var sýnið geislað með 640 nm leysigeislalínu og 660/20 nm bandpass filter var notaður til að greina merkið.
Safnaðar frumur voru settar í köggla með skilvindu (1110 snúningar á mínútu, 5 mínútur, 4°C) og geymdar við -80°C þar til þær voru notaðar. Mfn2cKO mýs og ungarnir þeirra eru flokkaðir sama dag til að lágmarka breytileika í aðferðum. Framsetning og greining á FACS gögnum var framkvæmd með FlowJo hugbúnaði (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, Bandaríkjunum).
Eins og áður hefur komið fram (59) er rauntíma PCR notuð til að einangra DNA úr flokkuðum taugafrumum til síðari magngreiningar á mtDNA. Línuleiki og þröskuldsnæmi voru upphaflega prófuð með því að keyra qPCR á mismunandi fjölda frumna. Í stuttu máli, safnaðu 300 PN í lýsisbuffer sem samanstendur af 50 mM tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20 og próteinasa K (200 ng/ml) og ræktaðu við 55°C í 120 mínútur. Frumurnar voru síðan ræktaðar við 95°C í 10 mínútur til að tryggja algjöra óvirkjun próteinasa K. Með því að nota TaqMan rannsakanda (Thermo Fisher) sem er sértækur fyrir mt-Nd1, var mtDNA mælt með hálf-magngreiningu PCR í 7900HT rauntíma PCR kerfinu (Thermo Fisher Scientific). Science, vörulistanúmer Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, vörulistanúmer AIVI3E8) og 18S (Thermo Fisher Scientific, vörulistanúmer Hs99999901_s1) gen.
Undirbúningur próteómsýnis. Með því að hita lausnina við 95°C í 10 mínútur og hljóðbylta hana í lýsislausn [6 M gúanidínklóríð, 10 mM tris(2-karboxýetýl)fosfínhýdróklóríð, 10 mM klórasetamíð og 100 mM tris-Lyse frosnar taugafrumukúlur í HCl]. Á Bioruptor (Diagenode) í 10 mínútur (30 sekúndna púls / 30 sekúndna hlé). Sýnið var þynnt 1:10 í 20 mM tris-HCl (pH 8,0), blandað saman við 300 ng af trypsíngull (Promega) og ræktað yfir nótt við 37°C til að ná fullkominni meltingu. Á öðrum degi var sýnið skilvindt við 20.000 g í 20 mínútur. Ofanvökvinn var þynntur með 0,1% maurasýru og lausnin afsöltuð með heimagerðum StageTips. Sýnið var þurrkað í SpeedVac tæki (Eppendorf concentrator plus 5305) við 45°C og síðan var peptíðið svifleyst í 0,1% maurasýru. Öll sýnin voru útbúin samtímis af sama einstaklingnum. Til að greina stjörnufrumusýni voru 4 μg af afsöltuðum peptíðum merkt með tandem massamerki (TMT10plex, vörunúmer 90110, Thermo Fisher Scientific) með hlutfalli peptíðs og TMT hvarfefnis upp á 1:20. Fyrir TMT merkingu voru 0,8 mg af TMT hvarfefni enduruppleyst í 70 μl af vatnsfríu ACN og þurrkaða peptíðið var endurleyst í 9 μl af 0,1 M TEAB (tríetýlammoníum bíkarbónati), sem 7 μl af TMT hvarfefni í ACN var bætt við. Styrkurinn var 43,75%. Eftir 60 mínútna ræktun var hvarfið slokknað með 2 μl af 5% hýdroxýlamíni. Merktu peptíðin voru safnað, þurrkuð, enduruppleyst í 200 μl af 0,1% maurasýru (FA), skipt í tvennt og síðan afsaltað með heimagerðum StageTips. Með því að nota UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph (UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph) var annar hvor helmingurinn aðgreindur á 1 mm x 150 mm Acquity litskiljunarsúlu fylltri með 130 Å1,7 μm C18 ögnum (Waters, vörulistanúmer SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Aðskiljið peptíðin með rennslishraða 30 μl/mín., aðskiljið frá 1% til 50% stuðpúða B í 85 mínútur með stigvaxandi halla upp á 96 mínútur, frá 50% til 95% stuðpúða B í 3 mínútur, síðan 8 mínútur fyrir 95% stuðpúða B; Stuðpúði A er 5% ACN og 10 mM ammóníumbíkarbónat (ABC), og stuðpúði B er 80% ACN og 10 mM ABC. Safnið brotum á 3 mínútna fresti og blandið þeim saman í tvo hópa (1 + 17, 2 + 18, o.s.frv.) og þurrkið þá í lofttæmisskilvindu.
LC-MS/MS greining. Fyrir massagreiningu voru peptíðin (númer r119.aq) aðskilin á 25 cm, 75 μm innra þvermál PicoFrit greiningarsúlu (ný hlutlinsa, hlutanúmer PF7508250) búin 1,9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ miðli (Dr. Maisch, mat), nota EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Þýskalandi). Súlan var geymd við 50°C. Stuðpúðar A og B eru 0,1% maurasýra í vatni og 0,1% maurasýra í 80% ACN, talið í sömu röð. Peptíðin voru aðskilin úr 6% í 31% stuðpúða B í 65 mínútur og úr 31% í 50% stuðpúða B í 5 mínútur með halla upp á 200 nl/mín. Útskoldu peptíðin voru greind á Orbitrap Fusion massagreini (Thermo Fisher Scientific). Mæling á m/z mælingu á peptíðforvera er framkvæmd með 120.000 upplausn á bilinu 350 til 1500 m/z. Með því að nota 27% staðlaða árekstrarorku er sterkasta forverinn með hleðsluástandi 2 til 6 valinn fyrir sundrun með háorku C-gildru (HCD). Hringrásartíminn er stilltur á 1 sekúndu. M/z gildi peptíðbrotsins var mælt í jónagildrunni með því að nota minnsta AGC skotmarkið 5×104 og hámarks innspýtingartíma 86 ms. Eftir sundrun var forverinn settur á útilokunarlista fyrir breytilegan efnisflokk í 45 sekúndur. TMT-merkt peptíð voru aðskilin á 50 cm, 75 μm Acclaim PepMap dálki (Thermo Fisher Scientific, vörulistanúmer 164942) og flutningsrófin voru greind á Orbitrap Lumos Tribrid massagreini (Thermo Fisher Scientific) búinn búnaði fyrir ósamhverfar bylgjulögunarjóna með háu sviði (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific) sem starfar við tvær jöfnunarspennur, −50 og −70 V. MS3, valið út frá samstillingarforveranum, er notað fyrir mælingar á TMT skýrslujónamerkinu. Peptíðaðskilnaðurinn var framkvæmdur á EASY-nLC 1200, með 90% línulegri hallaútskilnun, með stuðpúðaþéttni frá 6% til 31%; stuðpúði A var 0,1% FA og stuðpúði B var 0,1% FA og 80% ACN. Greiningarsúlan er starfrækt við 50°C. Notið FreeStyle (útgáfa 1.6, Thermo Fisher Scientific) til að skipta upprunalegu skránni í samræmi við FAIMS jöfnunarspennuna.
Próteinauðkenning og magngreining. Með því að nota samþætta Andromeda leitarvélina voru upprunalegu gögnin greind með MaxQuant útgáfu 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Auk Cre recombinasa og YFP raða sem fengust úr Aequorea victoria, var leitað í peptíðbrotaspektrum að upprunalegri röð og ísóformröð músaviðmiðunarpróteinsins (Próteinnúmer UP000000589, sótt af UniProt í maí 2017). Metíónínoxun og N-enda asetýlering próteina voru stilltar sem breytilegar breytingar; cystein karbamóýl metýlering var stillt sem fastar breytingar. Meltingarbreyturnar eru stilltar á „sértækni“ og „trypsín/P“. Lágmarksfjöldi peptíða og rakvélapeptíða sem notuð eru til próteinauðkenningar er 1; lágmarksfjöldi einstakra peptíða er 0. Við skilyrði peptíðkortasamsvörunar var próteinauðkenningartíðnin 0,01. Valkosturinn „Annað peptíð“ er virkur. Notið valkostinn „samsvörun milli keyrslna“ til að flytja vel heppnaðar auðkenningar milli mismunandi upprunalegra skráa. Notið lágmarkshlutfall LFQ talningar 1 fyrir merkingarlausa magngreiningu (LFQ) (60). LFQ styrkleiki er síaður fyrir að minnsta kosti tvö gild gildi í að minnsta kosti einum arfgerðarhópi á hverjum tímapunkti og er útreiknaður frá normaldreifingu með breidd 0,3 og færður niður um 1,8. Notið Perseus tölvunarfræðivettvang (https://maxquant.net/perseus/) og R (https://r-project.org/) til að greina LFQ niðurstöðurnar. Tvíhliða miðlungs t próf frá limma hugbúnaðarpakkanum var notað fyrir mismunandi tjáningargreiningu (61). Könnunargagnagreining er framkvæmd með ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally og pheatmap. TMT-byggð próteómfræðigögn voru greind með MaxQuant útgáfu 1.6.10.43. Leitið að hráum próteómfræðilegum gögnum úr gagnagrunni UniProt um próteómfræði hjá mönnum, sem var sóttur í september 2018. Greiningin inniheldur leiðréttingarstuðul fyrir samsætuhreinleika sem framleiðandinn lætur í té. Notið limma í R fyrir greiningu á mismunandi tjáningu. Upprunalegu gögnin, leitarniðurstöður gagnagrunnsins og vinnuflæði og niðurstöður gagnagreiningarinnar eru öll geymd í ProteomeXchange bandalaginu í gegnum samstarfsgagnasafnið PRIDE með gagnasafnsauðkenninu PXD019690.
Virkniskýringar auðga greininguna. QIAGEN tólið (Ingenuity Pathway Analysis) var notað til að ákvarða auðlegð virkniskýringaliða gagnasafnsins eftir 8 vikur (Mynd 1). Í stuttu máli er megindlegur próteinlisti, sem fenginn var úr LC-MS/MS (tandem massagreining) gagnagreiningu, notaður með eftirfarandi síuviðmiðum: Mus musculus er valinn sem tegund og bakgrunnur, og flokkurinn sýnir að P-gildi, sem Benjamini leiðrétti fyrir auðgun 0,05 eða lægri, er talið marktækt. Fyrir þetta graf eru sýndir fimm efstu umframflokkarnir í hverjum klasa byggt á leiðréttu P-gildi. Með því að nota margfeldis t-próf, tveggja þrepa línulega uppörvunarforrit Benjamini, Krieger og Yekutieli (Q = 5%), er tímabundin próteintjáningargreining framkvæmd á mikilvægum frambjóðendum sem greindir eru í hverjum flokki, og hver röð er greind sérstaklega. Það er engin þörf á að nota samræmda staðalfrávik.
Til að bera saman niðurstöður þessarar rannsóknar við birtar gagnagrunna og búa til Venn-rit á mynd 1, sameindum við megindlega próteinlistann með MitoCarta 2.0 skýringum (24). Notuðum nettólið Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) til að búa til ritið.
Nánari upplýsingar um tölfræðilegar aðferðir sem notaðar eru við próteómgreiningu er að finna í samsvarandi kafla undir Efni og aðferðir. Fyrir allar aðrar tilraunir er að finna ítarlegri upplýsingar í samsvarandi skýringartexta. Nema annað sé tekið fram eru öll gögn gefin upp sem meðaltal ± staðalfrávik (SEM) og allar tölfræðilegar greiningar voru framkvæmdar með GraphPad Prism 8.1.2 hugbúnaði.
Sjá nánari upplýsingar um þessa grein á http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Þessi grein er aðgengileg öllum samkvæmt skilmálum Creative Commons Attribution-Non-Commercial leyfisins, sem leyfir notkun, dreifingu og fjölföldun í hvaða miðli sem er, svo framarlega sem endanleg notkun er ekki í viðskiptalegum tilgangi og forsenda þess er að upprunalega verkið sé rétt. Heimild.
Athugið: Við biðjum þig aðeins um að gefa upp netfangið þitt svo að sá sem þú mælir með á síðunni viti að þú vilt að viðkomandi sjái tölvupóstinn og að hann sé ekki ruslpóstur. Við munum ekki safna neinum netföngum.
Þessi spurning er notuð til að kanna hvort þú sért gestur og koma í veg fyrir sjálfvirka ruslpóstsendingu.
Eftir E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Próteómgreining á óvirkum taugafrumum leiddi í ljós að efnaskiptakerfi eru virkjuð til að vinna gegn taugahrörnun.
Eftir E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Próteómgreining á óvirkum taugafrumum leiddi í ljós að efnaskiptakerfi eru virkjuð til að vinna gegn taugahrörnun.
©2020 American Association for the Advancement of Science. allur réttur áskilinn. AAAS er samstarfsaðili HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef og COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.