Þakka þér fyrir að heimsækja Nature.com. Útgáfan af vafranum sem þú notar hefur takmarkaðan CSS-stuðning. Til að ná sem bestum árangri mælum við með að þú notir nýrri útgáfu af vafranum þínum (eða slökkvir á samhæfingarstillingu í Internet Explorer). Á meðan, til að tryggja áframhaldandi stuðning, sýnum við síðuna án stíl eða JavaScript.
Própíónsýra (PPA) er notuð til að rannsaka hlutverk truflana á starfsemi hvatbera í taugaþroskaraskanir eins og einhverfurófsröskun. PPA er þekkt fyrir að raska myndun, efnaskiptum og veltu hvatbera. Hins vegar eru áhrif PPA á virkni, klofnun og samruna hvatbera enn vandasöm vegna flókins tímabundins eðlis þessara ferla. Hér notum við viðbótar megindlega myndgreiningartækni til að rannsaka hvernig PPA hefur áhrif á öfgabyggingu, formgerð og virkni hvatbera í taugafrumulíkum SH-SY5Y frumum. PPA (5 mM) olli marktækri minnkun á flatarmáli hvatbera (p < 0,01), þvermáli og ummáli fretunnar (p < 0,05) og flatarmáli 2 (p < 0,01). Greining á staðsetningarstaðsetningum hvatbera sýndi marktæka aukningu (p < 0,05) á klofnun og samruna, og þar með viðhélt heilleika hvatberanetsins við álagsaðstæður. Að auki minnkaði mRNA tjáning cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) og OPA1 (p < 0,05) marktækt. 01). Þetta sýnir fram á endurgerð á formgerð, lífmyndun og gangverki hvatbera til að viðhalda virkni við streituvaldandi aðstæður. Gögn okkar veita nýja innsýn í áhrif PPA á gangverk hvatbera og varpa ljósi á notagildi myndgreiningartækni til að rannsaka flóknu stjórnunarferlin sem taka þátt í streituviðbrögðum hvatbera.
Hvatberar gegna óaðskiljanlegum þáttum í fjölbreyttum frumustarfsemi, auk þess að gegna hefðbundnu hlutverki sínu í orkuframleiðslu og lífmyndun. Efnaskipti hvatbera eru lykilstjórnandi kalsíumboða, efnaskipta- og oxunar-afoxunarjafnvægis, bólguboða, erfðabreytinga, frumufjölgun, sérhæfingu og forrituðum frumudauða1. Einkum eru efnaskipti hvatbera mikilvæg fyrir þroska, lifun og virkni taugafruma og eru víða tengd ýmsum birtingarmyndum taugasjúkdóma2,3,4.
Á síðasta áratug hefur efnaskiptaástand komið fram sem miðlægur stjórnandi taugamyndunar, sérhæfingar, þroska og sveigjanleika5,6. Nýlega hefur formgerð og gangverk hvatbera orðið sérstaklega mikilvægir þættir í mítósu, kraftmiklu ferli sem viðheldur safni heilbrigðra hvatbera innan frumna. Gangverk hvatbera er stjórnað af flóknum, samtengdum ferlum sem spanna allt frá hvatberamyndun og líforku til hvatberaskiptingar, samruna, flutnings og úthreinsunar7,8. Röskun á einhverjum af þessum samþættingarferlum skerðir viðhald heilbrigðra hvatberaneta og hefur djúpstæðar afleiðingar fyrir taugaþroska9,10. Reyndar sést truflun á gangverki hvatbera í mörgum geðrænum, taugahrörnunar- og taugaþroskaraskanum, þar á meðal einhverfurófsröskunum (ASD)11,12.
ASD er ólíkgerð taugaþroskaraskanir með flókna erfða- og erfðafræðilega byggingu. Arfgengi ASD er óumdeilt, en undirliggjandi sameindafræðileg orsök er enn illa skilin. Söfnun gagna úr forklínískum líkönum, klínískum rannsóknum og fjölþátta sameindagagnasöfnum veita vaxandi vísbendingar um truflun á hvatberum í ASD13,14. Við framkvæmdum áður erfðamengisvítt DNA metýleringarskimun í hópi sjúklinga með ASD og greindum mismunandi metýleruð gen sem voru flokkuð eftir efnaskiptaferlum hvatbera15. Við greindum síðar frá mismunandi metýleringu miðlægra stjórnenda lífmyndunar og virkni hvatbera, sem tengdist aukinni fjöldi afrita af mtDNA og breyttri efnaskiptaferli þvagfæra í ASD16. Gögn okkar veita vaxandi vísbendingar um að hvatberavirkni og jafnvægi gegna lykilhlutverki í sjúkdómsfræði ASD. Því er að bæta skilning á vélrænum tengslum milli hvatberavirkni, formgerðar og virkni lykilmarkmið áframhaldandi rannsókna á taugasjúkdómum sem einkennast af afleiddri hvatberavirkni.
Sameindatækni er oft notuð til að rannsaka hlutverk tiltekinna gena í streituviðbrögðum hvatbera. Þessi aðferð getur þó verið takmörkuð af fjölþættri og tímabundinni eðli mítósustjórnunarkerfa. Ennfremur er mismunandi tjáning hvatberagena óbein vísbending um virknibreytingar, sérstaklega þar sem aðeins takmarkaður fjöldi gena er venjulega greindur. Því hafa verið lagðar til beinari aðferðir til að rannsaka starfsemi hvatbera og líforku17. Formgerð hvatbera er nátengd hvatberahreyfingum. Lögun, tengsl og uppbygging hvatbera eru mikilvæg fyrir orkuframleiðslu og lifun hvatbera og frumna5,18. Ennfremur einbeita hinir ýmsu þættir mítósu sér að breytingum á formgerð hvatbera, sem geta þjónað sem gagnlegir endapunktar fyrir truflun á starfsemi hvatbera og veitt grunn að síðari vélrænum rannsóknum.
Hægt er að skoða hvatbera beint með rafeindasmásjá (TEM), sem gerir kleift að rannsaka frumubyggingu ítarlega. TEM sýnir beint formgerð, lögun og uppbyggingu hvatberakristla við upplausn einstakra hvatbera, frekar en að reiða sig eingöngu á genaumritun, prótíntjáningu eða virknibreytur hvatbera í frumuhópum17,19,20. Að auki auðveldar TEM rannsóknir á víxlverkunum milli hvatbera og annarra frumulíffæra, svo sem frymisnetsins og sjálfsátsins, sem gegna lykilhlutverki í starfsemi hvatbera og jafnvægi21,22. Þetta gerir því TEM að góðum upphafspunkti til að rannsaka truflun á starfsemi hvatbera áður en einbeitt er að tilteknum ferlum eða genum. Þar sem starfsemi hvatbera verður sífellt mikilvægari fyrir taugasjúkdómafræði er skýr þörf á að geta rannsakað formgerð og virkni hvatbera beint og megindlega í in vitro taugafrumulíkönum.
Í þessari grein skoðum við hvatberastarfsemi í taugafræðilegu líkani af hvatberastarfsemi í einstaklingum með einhverfurófsröskun. Við höfum áður greint frá mismunandi metýleringu própíónýl-CoA karboxýlasa beta (PCCB) í ASD15, undireiningu hvatberaensímsins própíónýl-CoA karboxýlasa PCC. Vitað er að truflun á PCC veldur eitruðum uppsöfnun própíónýlafleiða, þar á meðal própíónsýru (PPA)23,24,25. Sýnt hefur verið fram á að PPA truflar taugaefnaskipti og breytir hegðun in vivo og er rótgróið dýralíkan til að rannsaka taugaþroskaferla sem taka þátt í ASD26,27,28. Að auki hefur verið greint frá því að PPA trufli frumuhimnu, lífmyndun og öndun hvatbera in vitro og hefur verið mikið notað til að líkja eftir hvatberastarfsemi í taugafrumum29,30. Hins vegar eru áhrif PPA-völdrar hvatberastarfsemi á formgerð og virkni hvatbera enn illa skilin.
Þessi rannsókn notar viðbótarmyndgreiningartækni til að magngreina áhrif PPA á formgerð, gangverk og virkni hvatbera í SH-SY5Y frumum. Fyrst þróuðum við TEM aðferð til að sjá breytingar á formgerð og öfgabyggingu hvatbera17,31,32. Miðað við kraftmikið eðli hvatbera33 notuðum við einnig staðsetningargreiningu hvatbera (MEL) til að magngreina breytingar á jafnvægi milli klofnunar og samruna atburða, fjölda og rúmmáls hvatbera undir PPA álagi. Að lokum skoðuðum við hvort formgerð og gangverk hvatbera tengist breytingum á tjáningu gena sem taka þátt í lífmyndun, klofnun og samruna. Samanlagt sýna gögn okkar áskorunina í að skýra flækjustig þeirra ferla sem stjórna gangverki hvatbera. Við leggjum áherslu á notagildi TEM við að rannsaka formgerð hvatbera sem mælanlegt samleitni endapunkt mítósu í SH-SY5Y frumum. Að auki leggjum við áherslu á að TEM gögn veita ríkustu upplýsingarnar þegar þau eru sameinuð myndgreiningartækni sem einnig fanga kraftmikla atburði sem bregðast við efnaskiptaálagi. Frekari greining á sameindastjórnunarferlum sem styðja mítósu taugafrumna gæti veitt mikilvæga innsýn í hvatberaþátt taugakerfisins og taugahrörnunarsjúkdóma.
Til að framkalla hvatberaálag voru SH-SY5Y frumur meðhöndlaðar með PPA með því að nota 3 mM og 5 mM natríumprópíónat (NaP). Fyrir TEM voru sýnin undirbúin með lágþrýstingsfrystingu og frystingu (Mynd 1a). Við þróuðum sjálfvirka myndgreiningarleiðni fyrir hvatbera til að mæla átta formfræðilega breytur hvatberastofna í þremur líffræðilegum endurteknum prófum. Við komumst að því að PPA meðferð breytti fjórum breytum verulega: flatarmáli 2, flatarmáli, ummál og þvermáli Feret (Mynd 1b-e). Flatarmál 2 minnkaði verulega með bæði 3 mM og 5 mM PPA meðferð (p = 0,0183 og p = 0,002, talið í sömu röð) (Mynd 1b), en flatarmál (p = 0,003), ummál (p = 0,0106) og þvermál Feret hafa öll minnkað verulega. Marktæk minnkun (p = 0,0172) varð í hópnum sem fékk 5 mM meðferð samanborið við samanburðarhópinn (Mynd 1c-e). Marktæk minnkun á flatarmáli og ummáli sýndi að frumur sem meðhöndlaðar voru með 5 mM PPA höfðu minni og ávölari hvatbera og að þessar hvatberar voru minna lengdar en þær í samanburðarfrumum. Þetta er einnig í samræmi við marktæka minnkun á Feret þvermáli, sem er óháður breyta sem gefur til kynna minnkun á mestu fjarlægð milli agnabrúna. Breytingar á öfgabyggingu kristanna sáust: kristarnir urðu minna áberandi undir áhrifum PPA streitu (Mynd 1a, mynd B). Hins vegar endurspegluðu ekki allar myndirnar greinilega öfgabyggingu kristanna, þannig að megindleg greining á þessum breytingum var ekki framkvæmd. Þessi TEM gögn geta endurspeglað þrjár mögulegar aðstæður: (1) PPA eykur klofnun eða hindrar samruna, sem veldur því að núverandi hvatberar minnka að stærð; (2) aukin lífmyndun skapar nýjar, minni hvatbera eða (3) örvar báða ferla samtímis. Þó að ekki sé hægt að greina á milli þessara aðstæðna með TEM, benda marktækar formfræðilegar breytingar til breytinga á jafnvægi og gangverki hvatbera undir PPA streitu. Við könnuðum síðan viðbótar breytur til að lýsa þessum gangverkum betur og hugsanlegum ferlum sem liggja að baki þeim.
Própíónsýra (PPA) breytir formgerð hvatbera. (a) Dæmigerðar myndir úr rafeindasmásjá (TEM) sem sýna að stærð hvatbera minnkar og hvatberar verða minni og ávölari með aukinni PPA meðferð; 0 mM (ómeðhöndluð), 3 mM og 5 mM, talið í sömu röð. Rauðar örvar gefa til kynna hvatbera. (b–e) SH-SY5Y frumur sem meðhöndlaðar voru með PPA í 24 klst. voru undirbúnar fyrir TEM og niðurstöðurnar greindar með Fiji/ImageJ. Fjórar af átta breytum sýndu marktækan mun á samanburðarfrumum (ómeðhöndluðum, 0 mM PPA) og meðhöndluðum frumum (3 mM og 5 mM PPA). (b) Svæði 2, (c) Flatarmál, (d) Jaðar, (e) Þvermál fretunnar. Einhliða dreifingargreining (viðmið vs. meðferð) og Dunnett fjölþátta samanburðarpróf voru notuð til að ákvarða marktækan mun (p < 0,05). Gagnapunktar tákna meðalgildi hvatbera fyrir hverja einstaka frumu og villustikur tákna meðaltal ± staðalfrávik. Gögn sem sýnd eru tákna n = 3, að minnsta kosti 24 frumur í hverri endurtekningu; samtals 266 myndir voru greindar; * gefur til kynna p < 0,05, ** gefur til kynna p < 0,01.
Til að lýsa frekar hvernig hvatberar bregðast við PPA, lituðum við hvatbera með tetrametýlrhodamín etýl ester (TMRE) og notuðum tímamælingarsmásjá og MEL greiningu til að staðsetja og magngreina hvatbera eftir 24 klukkustundir við 3 og 5 mM PPA. Meðferð við klofnun og samruna atburðum. (Mynd 2a). Eftir MEL greiningu voru hvatberar greindir frekar til að magngreina fjölda hvatberabygginga og meðalrúmmál þeirra. Við sáum litla en marktæka aukningu á fjölda klofnunaratburða sem áttu sér stað við 3 mM [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)] samanborið við klofnun [5,6 ± 0,3 (p < 0,05))] og samruna [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] 0,05)] <0,05)] jukust marktækt við 5 mM samanborið við samanburðarhóp (Mynd 3b). Fjöldi hvatbera jókst marktækt bæði við 3 [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)] og 5 mM [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] (Mynd 3c), en meðalrúmmál hverrar hvatberabyggingar var óbreytt (Mynd 3c). 3d). Samanlagt bendir þetta til þess að endurgerð hvatberahreyfingar þjóni sem jöfnunarviðbrögð sem viðheldur heilleika hvatberanetsins. Aukning á fjölda klofnunaratburða við 3 mM PPA bendir til þess að aukning á fjölda hvatbera sé að hluta til vegna klofnunar hvatbera, en þar sem meðalrúmmál hvatbera er nánast óbreytt er ekki hægt að útiloka lífmyndun sem viðbótar jöfnunarviðbrögð. Hins vegar eru þessar upplýsingar í samræmi við minni, kringlóttar hvatberabyggingar sem TEM hefur séð og sýna einnig fram á verulegar breytingar á hvatberahreyfingum sem PPA veldur.
Própíónsýra (PPA) örvar kraftmikla endurgerð hvatbera til að viðhalda heilindum netsins. SH-SY5Y frumur voru ræktaðar, meðhöndlaðar með 3 og 5 mM PPA í 24 klukkustundir og litaðar með TMRE og Hoechst 33342 og síðan MEL greiningu. (a) Dæmigerðar tímaskekkjusmásjármyndir sem sýna lit og tvíundaraðar hámarksstyrkleikavörpun á tíma 2 (t2) fyrir hvert ástand. Valin svæði sem merkt eru á hverri tvíundamynd eru uppfærð og birt í þrívídd á þremur mismunandi tímarömmum (t1-t3) til að sýna kraftinn með tímanum; samrunaatburðir eru auðkenndir með grænu; klofnunaratburðir eru auðkenndir með grænu. Sýnt með rauðu. (b) Meðalfjöldi kraftmikilla atburða á hvert ástand. (c) Meðalfjöldi hvatberabygginga á hverja frumu. (d) Meðalrúmmál (µm3) hverrar hvatberabyggingar á hverja frumu. Gögn sem sýnd eru eru dæmigerð fyrir n = 15 frumur á meðferðarhóp. Villustikur sem sýndar eru tákna meðaltal ± staðalfrávik, kvarðastika = 10 μm, * p < 0,05.
Própíónsýra (PPA) veldur umritunarbælingu gena sem tengjast hvatberastarfsemi. SH-SY5Y frumur voru meðhöndlaðar með 3 og 5 mM PPA í 24 klst. Hlutfallsleg genamagnsgreining var framkvæmd með RT-qPCR og staðlað að B2M. Hvatberamyndunargen (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 og (d) NFE2L2. Hvatberasamruna- og klofnunargen (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 og (i) DRP1. Marktækur munur (p < 0,05) var prófaður með einhliða ANOVA (viðmiðun vs. meðferð) og Dunnett fjölþátta samanburðarprófi: * gefur til kynna p < 0,05, ** gefur til kynna p < 0,01 og **** gefur til kynna p < 0,0001. Súlur tákna meðaltjáningu ± staðalfrávik. Gögnin sem sýnd eru tákna n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) og n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) líffræðilegar endurtekningar.
Gögn úr TEM og MEL greiningum saman benda til þess að PPA breyti formgerð og gangverki hvatbera. Þessar myndgreiningartækni veita þó ekki innsýn í undirliggjandi ferla sem knýja þessi ferli áfram. Við skoðuðum því mRNA tjáningu níu lykilstjórnenda hvatberagangverks, lífmyndunar og mítósu sem svar við PPA meðferð. Við magngreindum krabbameinsvaldandi gen í mergæxli (cMYC), kjarnaöndunarþátt (NRF1), umritunarþátt 1 hvatbera (TFAM), NFE2-líkan umritunarþátt BZIP (NFE2L2), gastrínlíkt prótein 2 (STOML2), rýrnun sjóntauga 1 (OPA1), mítófúsín 1 (MFN1), mítófúsín 2 (MFN2) og dynamín-tengt prótein 1 (DRP1) eftir 24 klukkustunda meðferð með 3 mM og 5 mM PPA. Við sáum 3 mM (p = 0,0053, p = 0,0415 og p < 0,0001, talið í sömu röð) og 5 mM (p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001) PPA meðferð. (Mynd 3a–c). Minnkunin á mRNA tjáningu var skammtaháð: tjáning cMYC, NRF1 og TFAM minnkaði um 5,7, 2,6 og 1,9 sinnum við 3 mM, talið í sömu röð, og um 11,2, 3 og 2,2 sinnum við 5 mM. Aftur á móti breyttist miðlæga redox lífmyndunargenið NFE2L2 ekki við neinn styrk PPA, þó að svipuð skammtaháð tilhneiging til minnkaðrar tjáningar hafi sést (Mynd 3d).
Við skoðuðum einnig tjáningu klassískra gena sem taka þátt í stjórnun á klofnun og samruna. Talið er að STOML2 taki þátt í samruna, frumuskiptum og lífmyndun og tjáning þess minnkaði marktækt (p < 0,0001) um 3 mM (2,4-föld breyting) og 5 mM (2,8-föld breyting) af PPA (Mynd 1). 3d). Á sama hátt minnkaði tjáning OPA1 samrunagensins við 3 mM (1,6-föld breyting) og 5 mM (1,9-föld breyting) af PPA (p = 0,006 og p = 0,0024, talið í sömu röð) (Mynd 3f). Hins vegar fundum við engan marktækan mun á tjáningu samrunagenanna MFN1, MFN2 eða klofnunargensins DRP1 við 24 klst. PPA álagi (Mynd 3g–i). Að auki komumst við að því að magn fjögurra samruna- og klofnunarpróteina (OPA1, MFN1, MFN2 og DRP1) breyttist ekki við sömu aðstæður (Mynd 4a–d). Mikilvægt er að hafa í huga að þessi gögn endurspegla einn tímapunkt og endurspegla hugsanlega ekki breytingar á prótíntjáningu eða virknistigi á fyrstu stigum PPA-streitu. Hins vegar bendir marktæk minnkun á tjáningu cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 og OPA1 til verulegrar umritunarröskunar á efnaskiptum, lífmyndun og virkni hvatbera. Að auki undirstrika þessi gögn notagildi myndgreiningartækni til að rannsaka beint breytingar á lokaástandi hvatberastarfsemi.
Próteinmagn í samruna- og klofnunarþátt breyttist ekki eftir meðferð með própíónsýru (PPA). SH-SY5Y frumur voru meðhöndlaðar með 3 og 5 mM PPA í 24 klst. Próteinmagn var magngreint með Western blot greiningu og tjáningarmagn staðlað miðað við heildarprótein. Meðalpróteintjáning og dæmigerð Western blot af mark- og heildarpróteini eru sýnd. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Súlurnar tákna meðaltal ± staðalfrávik og gögnin sem sýnd eru dæmigerð fyrir n = 3 líffræðilegar endurtekningar. Fjöldi samanburða (p < 0,05) var framkvæmdur með einstefnu dreifnigreiningu og Dunnett prófi. Upprunalega gelið og blotið eru sýnd á mynd S1.
Truflun á hvatberum tengist fjölkerfissjúkdómum, allt frá efnaskipta-, hjarta- og æðasjúkdómum og vöðvasjúkdómum til taugasjúkdóma1,10. Margir taugahrörnunarsjúkdómar og taugahrörnunarsjúkdómar tengjast truflun á hvatberum, sem undirstrikar mikilvægi þessara frumulíffæra alla ævi heilans. Þessir sjúkdómar eru meðal annars Parkinsonsveiki, Alzheimerssjúkdómur og einhverfurófssjúkdómur3,4,18. Hins vegar er aðgangur að heilavef til að rannsaka þessa sjúkdóma erfiður, sérstaklega á vélrænu stigi, sem gerir frumulíkankerfi að nauðsynlegum valkost. Í þessari rannsókn notum við frumulíkankerfi sem notar PPA-meðhöndlaðar SH-SY5Y frumur til að endurskapa truflun á hvatberum sem sést í taugasjúkdómum, sérstaklega einhverfurófsröskunum. Notkun þessa PPA líkans til að rannsaka hvatberadýnamík í taugafrumum gæti veitt innsýn í orsök einhverfu.
Við könnuðum möguleikann á að nota TEM til að skoða breytingar á formgerð hvatbera. Mikilvægt er að hafa í huga að TEM verður að nota rétt til að hámarka virkni þess. Undirbúningur frystingarsýna gerir kleift að varðveita taugafrumubyggingar betur með því að festa frumuþætti samtímis og draga úr myndun arfategunda34. Í samræmi við þetta komumst við að því að taugafrumulíkar SH-SY5Y frumur höfðu óskemmd undirfrumulíffæri og lengdar hvatbera (Mynd 1a). Þetta undirstrikar notagildi frystingartækni til að rannsaka formgerð hvatbera í taugafrumulíkönum. Þó að megindlegar mælingar séu mikilvægar fyrir hlutlæga greiningu á TEM gögnum, er enn engin samstaða um hvaða sértækar breytur ætti að mæla til að staðfesta formgerðarbreytingar á hvatberum. Byggt á fjölda rannsókna sem hafa megindlega skoðað formgerð hvatbera17,31,32, þróuðum við sjálfvirka myndgreiningarleiðslu fyrir hvatbera sem mælir átta formgerðarbreytur, þ.e.: flatarmál, flatarmál2, hlutfallslegan breidd, ummál, hringlaga lögun, gráður, þvermál og ávölleika.
Meðal þeirra minnkaði PPA marktækt flatarmál 2, flatarmál, ummál og Feret þvermál (Mynd 1b–e). Þetta sýndi að hvötfrumur urðu minni og ávölari, sem er í samræmi við fyrri rannsóknir sem sýndu minnkun á flatarmáli hvötfrumu eftir 72 klukkustundir af PPA30-völdum hvatberaálagi. Þessir formfræðilegu eiginleikar geta bent til klofnunar hvatbera, nauðsynlegs ferlis til að aðskilja skemmda íhluti úr hvatberanetinu til að stuðla að niðurbroti þeirra með mítókondríuáti35,36,37. Hins vegar gæti minnkun á meðalstærð hvatbera tengst aukinni lífmyndun, sem leiðir til myndunar lítilla, nýrra hvatbera. Aukin klofnun eða lífmyndun er jöfnunarviðbrögð til að viðhalda mítósu gegn hvatberaálagi. Hins vegar er ekki hægt að útiloka minnkaðan vöxt hvatbera, skerta samruna eða önnur skilyrði.
Þó að hágæða myndirnar sem TEM býr til leyfi ákvarða formfræðileg einkenni á stigi einstakra hvatbera, þá framleiðir þessi aðferð tvívíddarmyndir á einum tímapunkti. Til að rannsaka kraftmikla svörun við efnaskiptaálagi lituðum við hvatbera með TMRE og notuðum tímaskekkjusmásjá með MEL greiningu, sem gerir kleift að sjá þrívíddarmyndir af breytingum á hvatberanetinu með tímanum með mikilli afköstum33,38. Við sáum lúmskar en marktækar breytingar á hvatberahreyfingum undir PPA álagi (Mynd 2). Við 3 mM jókst fjöldi klofnunaratburða verulega, en samrunaatburðir voru þeir sömu og í samanburðarhópnum. Aukning á fjölda bæði klofnunar- og samrunaatburða sást við 5 mM PPA, en þessar breytingar voru nokkurn veginn í réttu hlutfalli, sem bendir til þess að klofnunar- og samrunahraðar nái jafnvægi við hærri styrk (Mynd 2b). Meðalrúmmál hvatbera var óbreytt bæði við 3 og 5 mM PPA, sem bendir til þess að heilleiki hvatberanetsins varðveittist (Mynd 2d). Þetta endurspeglar getu kraftmikilla hvatberaneta til að bregðast við vægu efnaskiptaálagi til að viðhalda jafnvægi á áhrifaríkan hátt án þess að valda sundrun netsins. Við 3 mM PPA er aukningin í klofnun nægjanleg til að stuðla að umbreytingu í nýtt jafnvægi, en þörf er á djúpstæðari hreyfiorkubreytingu sem svar við álagi sem orsakast af hærri styrk PPA.
Fjöldi hvatbera jókst við bæði PPA streituþéttni, en meðal hvatberarúmmál breyttist ekki marktækt (Mynd 2c). Þetta gæti stafað af aukinni lífmyndun eða aukinni skiptingu; Hins vegar, ef meðal hvatberarúmmál minnkar ekki verulega, er líklegra að lífmyndun aukist. Hins vegar styðja gögnin á mynd 2 tilvist tveggja jöfnunarferla: aukningu á fjölda klofnunaratburða, sem samræmist uppstjórnun á klofnun hvatbera, og aukningu á fjölda atburða, sem samræmist lífmyndun hvatbera. Að lokum getur kraftmikil jöfnun fyrir væga streitu falist í samtímis ferlum sem fela í sér klofnun, samruna, lífmyndun og mítóát. Þó fyrri höfundar hafi sýnt fram á að PPA eykur mítósu30,39 og mítóát29, þá veitum við vísbendingar um endurgerð á klofnun og samruna hvatbera sem svar við PPA. Þessi gögn staðfesta formfræðilegar breytingar sem sjást með TEM og veita frekari innsýn í ferla sem tengjast PPA-völdum hvatberatruflunum.
Þar sem hvorki TEM né MEL greining veittu beinar vísbendingar um stjórnunarferli gena sem liggja að baki þeim formfræðilegu breytingum sem komu fram, skoðuðum við RNA tjáningu gena sem taka þátt í efnaskiptum, lífmyndun og hreyfifræði hvatbera. Frumkrabbameinsgenið cMYC er umritunarþáttur sem tekur þátt í stjórnun hvatbera, glýkólýsu, amínósýru- og fitusýruefnaskipta40. Að auki er vitað að cMYC stjórnar tjáningu næstum 600 hvatberagena sem taka þátt í umritun, þýðingu og samsetningu fléttna hvatbera, þar á meðal NRF1 og TFAM41. NRF1 og TFAM eru tveir miðlægir stjórnendur mítósu, sem virka niðurstreymis PGC-1α til að virkja afritun mtDNA. Þessi leið er virkjuð með cAMP og AMPK boðleiðum og er viðkvæm fyrir orkunotkun og efnaskiptaálagi. Við skoðuðum einnig NFE2L2, oxunar-afoxunarstjórnanda lífmyndunar hvatbera, til að ákvarða hvort áhrif PPA gætu verið miðluð af oxunarálagi.
Þótt NFE2L2 tjáning hafi verið óbreytt, fundum við stöðuga skammtaháða lækkun á tjáningu cMYC, NRF1 og TFAM eftir 24 klst. meðferð með 3 mM og 5 mM PPA (Mynd 3a–c). Niðurstýring á cMYC tjáningu hefur áður verið greint frá sem svar við hvatberaálagi42, og öfugt getur niðurstýring á cMYC tjáningu valdið truflunum á hvatberum með því að endurbyggja efnaskipti hvatbera, nettengingu og himnupólun43. Athyglisvert er að cMYC tekur einnig þátt í stjórnun á klofnun og samruna hvatbera42,43 og er vitað að það eykur DRP1 fosfórun og staðsetningu hvatbera við frumuskiptingu44, sem og miðlar endurgerð hvatbera í taugastofnfrumum45. Reyndar sýna cMYC-skortir bandvefsfrumur minnkaða stærð hvatbera, sem samræmist breytingum sem PPA43 streita veldur. Þessi gögn sýna áhugavert en enn óljóst samband milli cMYC og hvatberahreyfinga, sem veitir áhugavert markmið fyrir framtíðarrannsóknir á endurgerð af völdum PPA streitu.
Minnkun NRF1 og TFAM er í samræmi við hlutverk cMYC sem mikilvægs umritunarvirkja. Þessar upplýsingar eru einnig í samræmi við fyrri rannsóknir á ristilkrabbameinsfrumum manna sem sýndu að PPA minnkaði tjáningu NRF1 mRNA eftir 22 klukkustundir, sem tengdist ATP-þurrð og aukningu á ROS46. Þessir höfundar greindu einnig frá því að tjáning TFAM jókst eftir 8,5 klukkustundir en fór aftur í upphafsgildi eftir 22 klukkustundir. Kim o.fl. (2019) sýndu hins vegar fram á að tjáning TFAM mRNA minnkaði marktækt eftir 4 klst. af PPA-álagi í SH-SY5Y frumum; hins vegar, eftir 72 klukkustundir, hafði tjáning TFAM próteina aukist marktækt og fjöldi mtDNA afrita jókst marktækt. Þannig útilokar fækkun hvatbera sem við sáum eftir 24 klukkustundir ekki þann möguleika að aukning á fjölda hvatbera tengist virkjun lífmyndunar á fyrri tímapunktum. Fyrri rannsóknir hafa sýnt að PPA eykur verulega PGC-1α mRNA og prótein í SH-SY5Y frumum eftir 4 klukkustundir og 30 mínútur, en própíónsýra eykur hvatberamyndun í kálfalifrarfrumum í gegnum PGC-1α eftir 12 klukkustundir og 39 mínútur. Athyglisvert er að PGC-1α er ekki aðeins bein umritunarstjórnandi NRF1 og TFAM, heldur hefur einnig verið sýnt fram á að það stjórnar virkni MFN2 og DRP1 með því að stjórna klofnun og samruna47. Samanlagt undirstrikar þetta náið samband ferla sem stjórna hvatberauppbótarsvörun sem PPA veldur. Ennfremur endurspegla gögn okkar verulega röskun á umritunarstjórnun á lífmyndun og efnaskiptum við PPA-streitu.
Genin STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 og DRP1 eru meðal meginstjórnenda hvatberaskiptingar, samruna og virkni37,48,49. Mörg önnur gen taka þátt í hvatberavirkni, en áður hefur verið komist að því að STOML2, OPA1 og MFN2 eru mismunandi metýleruð í ASD hópum,16 og nokkrar óháðar rannsóknir hafa greint frá breytingum á þessum umritunarþáttum sem svar við hvatberaálagi50,51.52. Tjáning bæði OPA1 og STOML2 minnkaði verulega við 3 mM og 5 mM PPA meðferð (Mynd 3e, f). OPA1 er einn af klassísku stjórnendum hvatberasamruna í gegnum bein samskipti við MFN1 og 2 og gegnir hlutverki í endurgerð krista og formgerð hvatbera53. Nákvæmt hlutverk STOML2 í hvatberavirkni er enn óljóst, en vísbendingar benda til þess að það gegni hlutverki í hvatberasamruna, lífmyndun og frumuskiptingum.
STOML2 tekur þátt í að viðhalda öndunartengingu hvatbera og myndun öndunarkeðjufléttna54,55 og hefur reynst hafa djúpstæð áhrif á efnaskiptaeiginleika krabbameinsfrumna56. Rannsóknir hafa sýnt að STOML2 stuðlar að möguleikum hvatberahimnu og lífefnamyndun með samspili við BAN og kardiolipín 55, 57, 58. Að auki hafa óháðar rannsóknir sýnt að samspil STOML2 og PINK1 stjórnar starfsemi hvatbera59,60. Athyglisvert er að greint hefur verið frá því að STOML2 hafi bein samskipti við og stöðugleika MFN2 og gegnir einnig mikilvægu hlutverki í að stöðuga langar OPA1 ísóform með því að hindra próteasa sem ber ábyrgð á niðurbroti OPA153,61,62. Minnkun á tjáningu STOML2 sem sést í PPA viðbrögðum gæti gert þessi samrunaprótein viðkvæmari fyrir niðurbroti í gegnum úbíkvítín- og próteasómháðar leiðir48. Þótt nákvæmt hlutverk STOML2 og OPA1 í kraftmiklu svörun við PPA sé óljóst, getur minnkuð tjáning þessara samrunagena (mynd 3) raskað jafnvægi milli klofnunar og samruna og leitt til minnkaðrar stærðar hvatbera (mynd 3).1).
Hins vegar var tjáning OPA1 próteins óbreytt eftir 24 klst., en mRNA og próteinmagn MFN1, MFN2 eða DRP1 breyttust ekki marktækt eftir PPA meðferð (Mynd 3g-i, Mynd 4). Þetta gæti bent til þess að engar breytingar séu á stjórnun þessara þátta sem taka þátt í samruna og klofnun hvatbera. Hins vegar er vert að taka fram að hvert þessara fjögurra gena er einnig stjórnað af eftirritunarbreytingum (PTM) sem stjórna próteinvirkni. OPA1 hefur átta aðrar splitsafbrigði sem eru próteinrofnar í hvatberum til að framleiða tvö aðskilin ísóform 63. Jafnvægið milli langra og stuttra ísóforma ræður að lokum hlutverki OPA1 í samruna hvatbera og viðhaldi hvatberanetsins 64. Virkni DRP1 er stjórnað af kalsíum/kalmódúlínháðri prótein kínasa II (CaMKII) fosfórun, en niðurbrot DRP1 er stjórnað af úbíkvítínun og SUMOýleringu 65. Að lokum eru bæði DRP1 og MFN1/2 GTPasar, þannig að virknin gæti verið undir áhrifum af framleiðsluhraða GTP í hvatberum 66. Þess vegna, þó að tjáning þessara próteina haldist stöðug, gæti þetta ekki endurspeglað óbreytta próteinvirkni eða staðsetningu 67,68. Reyndar þjóna núverandi PTM próteinforða oft sem fyrsta varnarlínan sem ber ábyrgð á að miðla bráðum streituviðbrögðum. Í viðurvist miðlungs efnaskiptaálags í líkani okkar er líklegt að PTM stuðli að aukinni virkni samruna- og klofnunarpróteina til að endurheimta heilleika hvatbera nægilega án þess að krefjast frekari virkjunar þessara gena á mRNA eða próteinstigi.
Þegar ofangreind gögn eru skoðuð samanlagt varpa þau ljósi á flókna og tímaháða stjórnun á formgerð hvatbera og áskoranirnar sem fylgja því að skýra þessa ferla. Til að rannsaka genatjáningu er fyrst nauðsynlegt að bera kennsl á tiltekna markgena í ferlinu. Hins vegar sýna gögn okkar að gen í sömu ferli bregðast ekki við sama álagi á sama hátt. Reyndar hafa fyrri rannsóknir sýnt að mismunandi gen í sömu ferli geta sýnt mismunandi tímabundin svörunarsnið30,46. Að auki eru flóknir eftir-umritunarferlar sem raska sambandinu milli umritunar og genastarfsemi. Próteómfræðilegar rannsóknir geta veitt innsýn í áhrif próteinfræðilegra efna og próteinstarfsemi, en þær fela einnig í sér áskoranir eins og lágafköst, hátt merkis-til-hávaðahlutfall og lélega upplausn.
Í þessu samhengi hefur rannsókn á formgerð hvatbera með því að nota TEM og MEL mikla möguleika á að svara grundvallarspurningum um tengslin milli virkni og virkni hvatbera og hvernig þetta hefur áhrif á sjúkdóma. Mikilvægast er að TEM býður upp á beina aðferð til að mæla formgerð hvatbera sem samleitinn endapunkt fyrir truflun og virkni hvatbera51. MEL býður einnig upp á beina aðferð til að sjá klofnun og samruna í þrívíðu frumuumhverfi, sem gerir kleift að magngreina virka endurgerð hvatbera jafnvel þótt breytingar séu ekki á genatjáningu33. Hér leggjum við áherslu á notagildi myndgreiningartækni hvatbera við afleiddar hvatberasjúkdóma. Þessir sjúkdómar einkennast venjulega af langvinnri vægri efnaskiptaálagi sem einkennist af lúmskri endurgerð hvatberakerfisins frekar en bráðum hvatberaskemmdum. Hins vegar hefur hvatberauppbótin sem þarf til að viðhalda mítósu við langvarandi álagi djúpstæðar afleiðingar fyrir virkni. Í samhengi taugavísinda gæti betri skilningur á þessum uppbótarferlum veitt mikilvægar upplýsingar um fjölþætta taugasjúkdómafræði sem tengist truflun á hvatberum.
Að lokum undirstrika gögn okkar notagildi myndgreiningartækni til að skilja virkniáhrif flókinna víxlverkunar milli genatjáningar, próteinbreytinga og próteinvirkni sem stjórna taugafrumuvirkni hvatbera. Við notuðum PPA til að líkja eftir truflunum á hvatberum í taugafrumulíkani til að fá innsýn í hvatberaþátt ASD. SH-SY5Y frumur sem meðhöndlaðar voru með PPA sýndu breytingar á hvatberaformgerð: hvatberar urðu smáir og kringlóttir og kristur voru illa skilgreindar þegar þær voru skoðaðar með TEM. MEL greining sýnir að þessar breytingar eiga sér stað samhliða aukningu á klofnun og samruna til að viðhalda hvatberanetinu sem svar við vægu efnaskiptaálagi. Ennfremur raskar PPA verulega umritunarstjórnun á efnaskiptum og jafnvægi hvatbera. Við greindum cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 og OPA1 sem lykil hvatberastjórnendur sem truflast af PPA-álagi og gætu gegnt hlutverki í að miðla PPA-völdum breytingum á formgerð og virkni hvatbera. Framtíðarrannsóknir eru nauðsynlegar til að lýsa betur PPA-völdum tímabundnum breytingum á genatjáningu og próteinvirkni, staðsetningu og breytingum eftir þýðingu. Gögn okkar varpa ljósi á flækjustig og innbyrðis tengsl stjórnkerfa sem miðla streituviðbrögðum hvatbera og sýna fram á notagildi TEM og annarra myndgreiningartækni fyrir markvissari rannsóknir á vélrænum sjúkdómum.
SH-SY5Y frumulínan (ECACC, 94030304-1VL) var keypt frá Sigma-Aldrich. SH-SY5Y frumur voru ræktaðar í Dulbecco's modified Eagle's medium/F-12 næringarefnablöndu (DMEM/F-12) og L-glútamíni (SC09411, ScienCell) í 25 cm2 flöskum bætt við 20% fósturkúasermi (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) og 1% penisillín-streptómýsín (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) við 37°C, 5% CO2. Frumurnar voru undirræktaðar þar til 80% samruni með því að nota 0,05% trypsín-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), skilvindaðar við 300 g og settar á plötur með þéttleika upp á um það bil 7 × 105 frumur/ml. Allar tilraunir voru gerðar á óaðgreindum SH-SY5Y frumum á milli 19.–22. PPA er gefið sem NaP. Leysið upp NaP duft (CAS nr. 137-40-6, efnaformúla C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) í volgu MilliQ vatni í 1 M styrk og geymið við 4°C. Á meðferðardegi skal þynna þessa lausn með 1 M PPA í 3 mM og 5 mM PPA í sermislausu miðli (DMEM/F-12 með L-glútamíni). Meðferðarstyrkur í öllum tilraunum var enginn PPA (0 mM, samanburður), 3 mM og 5 mM PPA. Tilraunirnar voru gerðar í að minnsta kosti þremur líffræðilegum endurtekningum.
SH-SY5Y frumum var sáð í 25 cm³ flöskur með hraðanum 5,5 × 10µ frumur/ml og ræktaðar í 24 klukkustundir. PPA meðferðin var bætt út í flöskuna fyrir 24 klukkustunda ræktun. Safnið frumukúlum samkvæmt venjulegum ræktunarferlum fyrir spendýravef (lýst hér að ofan). Enduruppleysið frumukúluna í 100 µl af 2,5% glútaraldehýði, 1× PBS og geymið við 4°C þar til vinnsla fer fram. SH-SY5Y frumurnar voru settar í skilvindu í stutta stund til að mynda kúlur úr frumunum og fjarlægja 2,5% glútaraldehýð, 1× PBS lausn. Enduruppleysið botnfallið í 4% agarósageli sem búið var til í eimuðu vatni (hlutfall agarósa og botnfallsrúmmáls er 1:1). Agarósabitarnir voru settir á grindur á sléttum plötum og húðaðir með 1-hexadeseni áður en þeir voru frystir við háþrýsting. Sýnin voru fryst í 100% þurru asetoni við -90°C í 24 klukkustundir. Hitastigið var síðan hækkað í -80°C og lausn af 1% osmíumtetroxíði og 0,1% glútaraldehýði bætt við. Sýnin voru geymd við -80°C í 24 klukkustundir. Eftir það var hitastigið smám saman hækkað í stofuhita yfir nokkra daga: frá –80°C í –50°C í 24 klukkustundir, í –30°C í 24 klukkustundir, í –10°C í 24 klukkustundir og að lokum í stofuhita.
Eftir lághitaundirbúning voru sýnin gegndreypuð með plastefni og úþunnar sneiðar (um 100 nm) voru gerðar með Leica Reichert UltracutS úþráðarsmásjá (Leica Microsystems). Sneiðarnar voru litaðar með 2% úranýlasetati og blýsítrati. Sýnin voru skoðuð með FEI Tecnai 20 rafeindasmásjá (ThermoFisher (áður FEI), Eindhoven, Hollandi) sem starfar við 200 kV (Lab6 sendandi) og Gatan CCD myndavél (Gatan, Bretlandi) sem er búin Tridiem orkusíu.
Í hverri tæknilegri endurtekningu voru teknar að minnsta kosti 24 myndir af einstökum frumutegundum, samtals 266 myndir. Allar myndirnar voru greindar með því að nota Region of Interest (ROI) makró og Mitochondria makró. Mitochondria makróið byggir á birtum aðferðum17,31,32 og gerir kleift að framkvæma hálf-sjálfvirka hópvinnslu á TEM myndum í Fiji/ImageJ69. Í hnotskurn: Myndin er snúið við og á hvolfi með því að nota bakgrunnsfrádrátt með rúllandi kúlu (60 pixla radíus) og FFT bandpass síu (með því að nota 60 og 8 pixla efri og neðri mörk, talið í sömu röð) og lóðrétta línubælingu með 5% stefnumörkunarvikmörkum. Vinnsla myndin er sjálfkrafa þröskuldsett með því að nota hámarks óreiða reiknirit og tvíundargríma er búin til. Myndasvæði sem tengjast handvirkt völdum ROI í hráum TEM myndum voru dregin út, þar sem mitochondria voru einkennd og plasmahimna og önnur svæði með mikilli birtuskil voru útilokuð. Fyrir hvert útdregið arð (ROI) voru tvíundaragnir stærri en 600 pixlar greindar og flatarmál agna, ummál, stór- og smáásar, Feret-þvermál, kringlóttleiki og hringlaga eðli mæld með innbyggðum mæliföllum Fiji/ImageJ. Samkvæmt Merrill, Flippo og Strack (2017) voru flatarmál 2, hlutfall agna (hlutfall stór- og smáása) og lögunarstuðull (FF) reiknuð út frá þessum gögnum, þar sem FF = ummál 2/4pí x flatarmál. Skilgreiningu á breytuformúlunni er að finna í Merrill, Flippo og Strack (2017). Makróarnir sem nefndir eru eru aðgengilegir á GitHub (sjá yfirlýsingu um tiltækileika gagna). Að meðaltali voru um það bil 5.600 agnir greindar á hverri PPA meðferð, samtals um það bil 17.000 agnir (gögn ekki sýnd).
SH-SH5Y frumur voru settar í 8-hólfa ræktunarskálar (ThermoFisher, #155411) til að leyfa viðloðun yfir nótt og síðan ræktaðar með TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) og Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). Myndir voru teknar með 405 nm og 561 nm leysigeislum yfir 10 mínútna umhverfi og hráar myndir voru teknar sem z-staflar sem innihéldu 10 myndasmásjármyndir með az-skrefi upp á 0,2 μm milli myndaramma á 12 samfelldum tímapunktum. Myndir voru teknar með Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 ofurupplausnarpalli (Carl Zeiss, Oberkochen, Þýskalandi) með LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27 linsu. Myndir voru greindar í ImageJ með því að nota áður lýsta leiðslu og ImageJ viðbótina til að mæla samruna- og klofnunaratburði, meðalfjölda hvatberabygginga og meðalrúmmál hvatbera á hverja frumu33. MEL-makró eru aðgengileg á GitHub (sjá yfirlýsingu um tiltækileika gagna).
SH-SY5Y frumur voru ræktaðar í sex hols plötum með þéttleikanum 0,3 × 106 frumur/ml í 24 klukkustundir fyrir meðferð. RNA var dregið út með Quick-RNA™ Miniprep aðferðinni (ZR R1055, Zymo Research) með smávægilegum breytingum: bætið 300 μl af RNA lýsislausn í hvern hol áður en það er fjarlægt og lýsið hvert sýni sem lokaskref með 30 μl af DNasa/RNasa útskilnaðarlausu vatni. Öll sýni voru könnuð með tilliti til magns og gæða með NanoDrop ND-1000 UV-Vis litrófsmæli. Heildarprótein úr frumulýsum var fengið með því að nota 200 μl af RIPA lýsislausn og próteinþéttni var magngreind með Bradford próteinprófinu70.
cDNA-myndun var framkvæmd með Tetro™ cDNA-myndunarbúnaðinum (BIO-65043, Meridian Bioscience) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda með nokkrum breytingum. cDNA var myndað í 20 μl viðbrögðum með því að nota 0,7 til 1 μg af heildar-RNA. Praimerar voru valdir úr áður birtum greinum 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Tafla S1) og meðfylgjandi rannsakendur voru hannaðir með PrimerQuest tólinu frá Integrated DNA Technologies. Öll gen sem um ræðir voru staðluð miðað við kjarna B2M genið. Genatjáning STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC og OPA1 var mæld með RT-qPCR. Aðalblandan innihélt LUNA Taq pólýmerasa (M3003L, New England Biolabs), 10 μM framvirkar og afturvirkar praimerar, cDNA og PCR-gæða vatn til að fá lokarúmmál upp á 10 μL fyrir hverja viðbrögð. Tjáning skiptingar- og klofnunargena (DRP1, MFN1/2) var mæld með TaqMan fjölþáttaprófum. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) var notuð samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda með minniháttar breytingum. Fjölþátta RT-qPCR aðalblandan inniheldur 1X LUNA Taq pólýmerasa, 10 μM framvirkar og afturvirkar praimerar, 10 μM rannsaka, cDNA og PCR-gæða vatn, sem gefur lokarúmmál upp á 20 μL fyrir hverja viðbrögð. RT-qPCR var framkvæmd með Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG - raðnúmer: R0618110). Hringrásarskilyrði eru sýnd í töflu S1. Öll cDNA sýni voru þríritiuð og staðalkúrfa var búin til með tífaldri þynningu. Útlæg gildi í þrírituðum sýnum með staðalfráviki (Ct) >0,5 voru fjarlægð úr greiningunni til að tryggja endurtekningarhæfni gagna30,72. Hlutfallsleg genatjáning var reiknuð með 2-ΔΔCt79 aðferðinni.
Próteinsýni (60 μg) voru blönduð við Laemmli hleðslulausn í hlutfallinu 2:1 og keyrð á 12% litlausu próteingeli (Bio-Rad #1610184). Próteinin voru flutt yfir á PVDF (pólývínýlidenflúoríð) himnu (#170-84156, Bio-Rad) með því að nota Trans-Blot Turbo kerfið (#170-4155, Bio-Rad). Himnunni var lokað og hún ræktuð með viðeigandi frummótefnum (OPA1, MFN1, MFN2 og DRP1) (þynnt 1:1000) í 48 klukkustundir, og síðan með aukamótefnum (1:10.000) í 1 klukkustund. Himnurnar voru síðan myndaðar með Clarity Western ECL Substrate (#170-5061, Bio-Rad) og skráðar með Bio-Rad ChemiDoc MP kerfi. ImageLab útgáfa 6.1 var notuð fyrir Western blot greiningu. Upprunalega gelið og blettið eru sýnd á mynd S1. Upplýsingar um mótefni eru í töflu S2.
Gagnasöfn eru kynnt sem meðaltal og staðalfrávik meðaltals (SEM) að minnsta kosti þriggja óháðra úrtaka. Gagnasöfnin voru prófuð til að meta eðlilegleika með Shapiro-Wilks prófinu (nema annað sé tekið fram) áður en gert var ráð fyrir Gauss-dreifingu og jöfnum staðalfrávikum og haldið var áfram með greiningarnar. Auk þess var gagnasafninu greint með Fisher's MEL LSD (p < 0,05), einhliða ANOVA (meðaltal meðferðar vs. samanburðar) og Dunnett's margfeldis samanburðarprófi til að ákvarða marktækni (p < 0,05). Marktæk p gildi eru sýnd á grafinu sem *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Allar tölfræðilegar greiningar og gröf voru framkvæmd og búin til með GraphPad Prism 9.4.0.
Makró fyrir Fiji/ImageJ myndgreiningu eru aðgengileg almenningi á GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Makróið Mitochondrial Event Locator (MEL) er aðgengilegt almenningi á GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM og Vijaya A. Hvatberar: Meistarastjórnendur efnaskipta, jafnvægis, streitu, öldrunar og erfðafræði. Indónesíska. Líftækni. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Fjölþætt truflun á starfsemi hvatbera í geðklofa, flókið I sem mögulegt meinafræðilegt skotmark. Schizophrenia. resource. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. og Beal, MF Hvatberastarfsemi í Parkinsonsveiki. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG og Mehta V. Álagðar hvatberar: skotmörk innrásar í Alzheimerssjúkdómi. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF og Ferreira GK. Hvatberar og heilinn: líforkufræði og fleira. Taugaeiturefni. resource. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. o.fl. Fljútrópísk hvatberar: áhrif hvatbera á taugaþroska og sjúkdóma. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. og Morais, VA. Æxlun hvatbera í taugafrumum: hvernig og hvar. alþjóðahyggja. J. Mohr. vísindin. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. og Zhao, J. Stjórnun á hvatberastarfsemi spendýra: tækifæri og áskoranir. framan. innkirtlakerfi. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. og Slack, RS Hvatberahreyfingar í stjórnun taugamyndunar: frá þroska til fullorðinsheila. þróun. hreyfifræði. 247, 47–53 (2018).