Þakka þér fyrir að heimsækja Nature.com. Vafraútgáfan sem þú notar styður CSS takmarkað. Til að fá sem bestu upplifun mælum við með að þú notir uppfærðan vafra (eða slökkvir á samhæfingarstillingu í Internet Explorer). Á meðan, til að tryggja áframhaldandi stuðning, munum við birta síðuna án stíla og JavaScript.
Insúlínnanóagnir (NP) með hátt hleðsluinnihald hafa fundið mismunandi notkunarmöguleika í mismunandi skammtaformum. Markmið þessarar vinnu er að meta áhrif frostþurrkunar- og úðaþurrkunarferla á uppbyggingu insúlínhlaðinna kítósannanóagna, með eða án mannitóls sem frostvarnarefnis. Við metum einnig gæði þessara nanóagna með því að leysa þær upp aftur. Fyrir þurrkun var agnastærð kítósan/natríumtrípólýfosfat/insúlín þverbundinna nanóagna fínstillt í 318 nm, PDI var 0,18, innhylkingarhagkvæmni var 99,4% og hleðslan var 25,01%. Eftir enduruppbyggingu héldu allar nanóagnir, nema þær sem framleiddar voru með frostþurrkunaraðferð án notkunar mannitóls, kúlulaga agnabyggingu sinni. Í samanburði við mannitól-innihaldandi nanóagnir sem voru þurrkuð með annað hvort úða, sýndu mannitóllausar úðaþurrkaðar nanóagnir einnig minnstu meðalagnastærðina (376 nm) og hæsta hleðsluinnihaldið. (25,02%) með svipaðri innhylkunarhraða (98,7%) og PDI (0,20) með þurrkunar- eða frystþurrkunaraðferðum. Þurrkuðu nanóagnirnar með úðaþurrkun án mannítóls leiddu einnig til hraðari losunar insúlíns og mestrar skilvirkni frumuupptöku. Þessi vinna sýnir að úðaþurrkun getur þurrkað insúlínnanóagnir án þess að þörf sé á frostvörn samanborið við hefðbundnar frostþurrkunaraðferðir, sem skapar meiri hleðslugetu, minni aukefnaþörf og rekstrarkostnað sem er verulegur kostur.
Frá því að insúlín var uppgötvað árið 19221,2,3 hafa lyf þess bjargað lífi sjúklinga með sykursýki af tegund 1 (T1DM) og sykursýki af tegund 2 (T1DM). Hins vegar, vegna eiginleika þess sem prótein með háa mólþunga, safnast insúlín auðveldlega saman, brotnar niður af próteinkljúfandi ensímum og skilst út með fyrstu umferðarferlisáhrifum. Fólk sem greinist með sykursýki af tegund 1 þarfnast insúlínsprauta það sem eftir er ævinnar. Margir sjúklingar sem greinast upphaflega með sykursýki af tegund 2 þurfa einnig langtíma insúlínsprautur. Daglegar insúlínsprautur eru alvarleg uppspretta daglegs sársauka og óþæginda fyrir þessa einstaklinga, með neikvæðum áhrifum á geðheilsu. Fyrir vikið eru aðrar gerðir insúlíngjafar sem valda minni óþægindum, svo sem insúlíngjöf til inntöku, rannsakaðar ítarlega5 þar sem þær hafa möguleika á að endurheimta lífsgæði um það bil 5 milljarða manna með sykursýki um allan heim.
Nanóagnatækni hefur veitt verulegar framfarir í tilraunum til að taka insúlín til inntöku4,6,7. Tækni sem umlykur og verndar insúlín á áhrifaríkan hátt gegn niðurbroti til markvissrar afhendingar á tiltekna líkamshluta. Notkun nanóagnaformúla hefur þó nokkrar takmarkanir, aðallega vegna stöðugleika agnasviflausna. Nokkur samloðun getur átt sér stað við geymslu, sem dregur úr aðgengi insúlínhlaðinna nanóagna8. Að auki verður einnig að hafa í huga efnafræðilegan stöðugleika fjölliðu nanóagna og insúlíns til að tryggja stöðugleika insúlínnanóagna (NPs). Eins og er er frostþurrkunartækni gullstaðallinn til að búa til stöðugar NPs og koma í veg fyrir óæskilegar breytingar við geymslu9.
Hins vegar krefst frostþurrkun þess að bæta við frostvarnarefnum til að koma í veg fyrir að kúlulaga uppbygging nanóagna verði fyrir áhrifum af vélrænu álagi ískristalla. Þetta dregur verulega úr magni insúlínnanóagna eftir frostþurrkun, þar sem frostvarnarefnið tekur upp stærstan hluta þyngdarhlutfallsins. Þess vegna eru framleiddar insúlínnanóagnir oft óhentugar til framleiðslu á þurrum duftformúlum, svo sem töflum og filmum til inntöku, vegna þess að þörf er á miklu magni af þurrum nanóögnum til að ná meðferðarglugga insúlínsins.
Úðaþurrkun er vel þekkt og ódýr aðferð í iðnaðarskala til að framleiða þurrduft úr fljótandi fösum í lyfjaiðnaðinum10,11. Stjórnun á agnamyndunarferlinu gerir kleift að innhylla nokkur lífvirk efnasambönd rétt 12, 13. Ennfremur hefur það orðið áhrifarík aðferð til að framleiða innhylkt prótein til inntöku. Við úðaþurrkun gufar vatn upp mjög hratt, sem hjálpar til við að halda hitastigi agnakjarnans lágu11,14, sem gerir kleift að nota það til að innhylla hitanæma þætti. Fyrir úðaþurrkun ætti að blanda húðunarefninu vandlega saman við lausnina sem inniheldur innhylkuðu innihaldsefnin11,14. Ólíkt frostþurrkun bætir einsleitni fyrir innhyllun í úðaþurrkun innhyllunarvirkni við þurrkun. Þar sem innhyllunarferlið með úðaþurrkun krefst ekki frostvarnarefna, er hægt að nota úðaþurrkun til að framleiða þurrkaðar nanóagnir með hátt hleðsluinnihald.
Þessi rannsókn greinir frá framleiðslu á insúlínhlaðnum nanóögnum með þvertengingu kítósans og natríumtrípólýfosfats með jónagelaðferð. Jónagelmyndun er undirbúningsaðferð sem gerir kleift að framleiða nanóagnir með rafstöðuvirkum víxlverkunum milli tveggja eða fleiri jónategunda við ákveðnar aðstæður. Bæði frostþurrkunar- og úðaþurrkunartækni voru notaðar til að þurrka bestu kítósan/natríumtrípólýfosfat/insúlín þvertengdu nanóagnirnar. Eftir þurrkun var formgerð þeirra greind með rafeindasmásjá. Endurröðunarhæfni þeirra var metin með því að mæla stærðardreifingu þeirra, yfirborðshleðslu, PDI, innhyllunarhagkvæmni og hleðsluinnihald. Gæði endurleysanlegra nanóagna sem framleiddar voru með mismunandi þurrkunaraðferðum voru einnig metin með því að bera saman insúlínvernd þeirra, losunarhegðun og frumuupptökuhagkvæmni.
Sýrustig blönduðu lausnarinnar og hlutfall kítósans og insúlíns eru tveir lykilþættir sem hafa áhrif á agnastærð og innhyllunarhagkvæmni (EE) loka nanóagnanna, þar sem þeir hafa bein áhrif á jónótrópíska gelmyndunarferlið. Sýnt var fram á að sýrustig blönduðu lausnarinnar var mjög tengt agnastærð og innhyllunarhagkvæmni (Mynd 1a). Eins og sést á mynd 1a, þegar sýrustig hækkaði úr 4,0 í 6,0, minnkaði meðalagnastærðin (nm) og EE jókst verulega, en þegar sýrustig hækkaði í 6,5, byrjaði meðalagnastærðin að aukast og EE hélst óbreytt. Þegar hlutfall kítósans og insúlíns eykst, eykst meðalagnastærðin einnig. Ennfremur sást engin breyting á EE þegar nanóagnir voru búnar til við massahlutfall kítósans/insúlíns sem var hærra en 2,5:1 (w/w) (Mynd 1b). Þess vegna voru bestu undirbúningsskilyrðin í þessari rannsókn (pH 6,0, massahlutfall kítósans/insúlíns 2,5:1) notuð. til að útbúa insúlínhlaðnar nanóagnir til frekari rannsókna. Við þessar undirbúningsaðstæður var meðal agnastærð insúlínnanóagna fínstillt í 318 nm (Mynd 1c), PDI var 0,18, innfellingarhagkvæmni var 99,4%, zeta-spennan var 9,8 mV og insúlínhleðslan var 25,01% (m/m). Samkvæmt niðurstöðum rafeindasmásjárskoðunar (TEM) voru fínstilltu nanóagnirnar nokkurn veginn kúlulaga og stakar með tiltölulega einsleitri stærð (Mynd 1d).
Bestun breytna á insúlínnanóögnum: (a) áhrif pH á meðalþvermál og innhyllunarhagkvæmni (EE) insúlínnanóagna (búnar til með massahlutfalli 5:1 af kítósani og insúlíni); (b) kítósan og áhrif massahlutfalls insúlíns á meðalþvermál og innhyllunarhagkvæmni (EE) insúlínnanóagna (búnar til við pH 6); (c) agnastærðardreifing bestu insúlínnanóagna; (d) TEM smásjármynd af bestu insúlínnanóagnum.
Það er vel þekkt að kítósan er veikt fjölrafmagn með pKa gildi upp á 6,5. Það er jákvætt hlaðið í súrum miðlum vegna þess að aðal amínóhópurinn er róteindaður af vetnisjónum15. Þess vegna er það oft notað sem burðarefni til að innhylja neikvætt hlaðnar stórsameindir. Í þessari rannsókn var kítósan notað til að innhylja insúlín með ísórafpunkti upp á 5,3. Þar sem kítósan er notað sem húðunarefni, eykst þykkt ytra lags nanóagnanna samsvarandi með auknu hlutfalli þess, sem leiðir til stærri meðalagnastærðar. Að auki getur hærra magn af kítósan innhyllað meira insúlín. Í okkar tilviki var EE hæst þegar hlutfall kítósans og insúlíns náði 2,5:1, og engin marktæk breyting varð á EE þegar hlutfallið hélt áfram að aukast.
Auk hlutfallsins milli kítósans og insúlíns gegndi sýrustig (pH) einnig lykilhlutverki í framleiðslu nanóagna. Gan o.fl. 17 rannsökuðu áhrif sýrustigs (pH) á agnastærð kítósan nanóagna. Þeir fundu stöðuga lækkun á agnastærð þar til sýrustigið náði 6,0, og veruleg aukning á agnastærð sást við sýrustig > 6,0, sem er í samræmi við athuganir okkar. Þetta fyrirbæri stafar af því að með hækkandi sýrustigi fær insúlínsameindin neikvæða yfirborðshleðslu, sem ýtir undir rafstöðuvirkni við kítósan/natríumtrípólýfosfat (TPP) fléttuna, sem leiðir til lítillar agnastærðar og mikils rafeindavirkni (EE). Hins vegar, þegar sýrustigið var stillt á 6,5, afrótóneruðust amínóhóparnir á kítósani, sem leiddi til kítósanbrotningar. Þannig leiðir hátt sýrustig til minni útsetningar amínójóna fyrir TPP og insúlíni, sem leiðir til minni þvertengingar, stærri lokameðaltals agnastærðar og minni rafeindavirkni.
Greining á formfræðilegum eiginleikum frostþurrkuðu og úðaþurrkuðu nanóagna getur leiðbeint vali á betri aðferðum við þurrkun og duftmyndun. Æskileg aðferð ætti að veita lyfjastöðugleika, einsleita agnalögun, mikla lyfjahleðslu og góða leysni í upprunalegu lausninni. Í þessari rannsókn, til að bera saman aðferðirnar tvær betur, voru insúlín-nanóagnir með eða án 1% mannítóls notaðar við þurrkun. Mannítól er notað sem fyllingarefni eða frostverndarefni í ýmsum þurrduftformúlum fyrir frostþurrkun og úðaþurrkun. Fyrir frostþurrkuðu insúlín-nanóagnirnar án mannítóls, eins og sýnt er á mynd 2a, sást mjög porous duftbygging með stórum, óreglulegum og hrjúfum yfirborðum undir rafeindasmásjá (SEM). Fáar stakar agnir greindust í duftinu eftir þurrkun (mynd 2e). Þessar niðurstöður bentu til þess að flestir nanóagnir brotnuðu niður við frostþurrkun án frostverndarefnis. Fyrir frostþurrkuðu og úðaþurrkuðu insúlín-nanóagnir sem innihéldu 1% mannítól sáust kúlulaga nanóagnir með sléttum yfirborðum (mynd 2b, d, f, h). Insúlín Nanóagnir sem voru úðaþurrkaðar án mannítóls héldust kúlulaga en hrukkuðu á yfirborðinu (Mynd 2c). Kúlulaga og hrukkuð yfirborð eru rædd nánar í losunarhegðun og frumuupptökuprófunum hér að neðan. Byggt á sýnilegu útliti þurrkuðu nanóagnanna, gáfu bæði úðaþurrkaðar nanóagnir án mannítóls og nanóagnir sem voru frystþurrkaðar og úðaþurrkaðar með mannítóli fínt nanóagnaduft (Mynd 2f, g, h). Því stærra sem yfirborðsflatarmál agnanna er, því meiri er leysnin og þar af leiðandi meiri losunarhraði.
Formgerð mismunandi þurrkaðra insúlín-nanopartíkla: (a) SEM mynd af frostþurrkuðum insúlín-nanopartíklum án mannítóls; (b) SEM mynd af frostþurrkuðum insúlín-nanopartíklum með mannítóli; (c) úðaþurrkuðum insúlín-nanopartíklum án mannítóls SEM mynd af; (d) SEM mynd af insúlín-nanopartíklum úðaþurrkuðum með mannítóli; (e) mynd af frostþurrkuðum insúlín-nanopartíklum í dufti án mannítóls; (f) mynd af frostþurrkuðum insúlín-nanopartíklum með mannítóli; (g) Mynd af úðaþurrkuðum insúlín-nanopartíklum í dufti án mannítóls; (h) mynd af úðaþurrkuðum insúlín-nanopartíklum í dufti með mannítóli.
Við frostþurrkun virkar mannitól sem frostvörn, heldur nanóagnum í ókristalla formi og kemur í veg fyrir skemmdir af völdum ískristalla19. Aftur á móti er ekkert frystistig við úðaþurrkun. Því er ekki þörf á mannitóli í þessari aðferð. Reyndar gáfu úðaþurrkaðar nanóagnir án mannitóls fínni nanóagnir eins og áður hefur verið lýst. Hins vegar getur mannitól samt virkað sem fylliefni í úðaþurrkunarferlinu til að gefa nanóagnunum kúlulagaðri byggingu20 (Mynd 2d), sem hjálpar til við að fá einsleita losunarhegðun slíkra innhúðaðra nanóagna. Að auki er ljóst að nokkrar stórar agnir má greina bæði í frostþurrkuðum og úðaþurrkuðum insúlín-nanóagnum sem innihalda mannitól (Mynd 2b, d), sem gæti stafað af uppsöfnun mannitóls í agnakjarnanum ásamt innhúðaða insúlíninu. Til. Kítósanlag. Það er vert að taka fram að í þessari rannsókn, til að tryggja að kúlulaga uppbyggingin haldist óbreytt eftir ofþornun, er hlutfall mannítóls og kítósans haldið við 5:1, þannig að mikið magn af fylliefni geti einnig aukið agnastærð þurrkuðu nanópróteina.
Fourier umbreytingar innrauða, dempaðri heildarendurspeglun (FTIR-ATR) litrófsgreining einkenndi efnislega blöndu af fríu insúlíni, kítósani, kítósani, TPP og insúlíni. Öllum þurrkuðum nanóagnum var lýst með FTIR-ATR litrófsgreiningu. Athyglisvert er að bandstyrkur 1641, 1543 og 1412 cm-1 sást í innhýddum nanóagnum sem frystþurrkuðust með mannítóli og í nanóagnum sem úðaþurrkuðust með og án mannítóls (Mynd 3). Eins og áður hefur verið greint frá tengdist þessi aukning á styrk þvertengingu milli kítósans, TPP og insúlíns. Rannsókn á víxlverkun milli kítósans og insúlíns sýndi að í FTIR litrófinu á insúlínhlaðnum kítósan nanóögnum skarast bandið á kítósan við bandið á insúlíni, sem jók styrkleika karbónýls (1641 cm-1) og amíns (1543 cm-1) beltisins. Trípólýfosfathóparnir í TPP eru tengdir ammóníumhópum í kítósani og mynda band við 1412 cm-1.
FTIR-ATR litróf af fríu insúlíni, kítósani, eðlisfræðilegum blöndum af kítósan/TPP/insúlíni og NP sem hafa verið þurrkuð með mismunandi aðferðum.
Ennfremur eru þessar niðurstöður í samræmi við þær sem sýndar voru í SEM, sem sýndi að innhylkuðu nanóagnirnar héldust óbreyttar bæði við úðun og frystþurrkun með mannitóli, en í fjarveru mannitóls framleiddu aðeins úðaþurrkun innhylktar agnir. Aftur á móti voru FTIR-ATR litrófsniðurstöður af nanóagnum sem frystþurrkuðust án mannitóls mjög svipaðar efnislegri blöndu kítósans, TPP og insúlíns. Þessi niðurstaða bendir til þess að þvertengingar milli kítósans, TPP og insúlíns séu ekki lengur til staðar í nanóagnum sem frystþurrkuðust án mannitóls. Uppbygging nanóagnanna eyðilagðist við frystþurrkun án frostvarnarefnis, sem sjá má í SEM niðurstöðunum (Mynd 2a). Byggt á formgerð og FTIR niðurstöðum afvötnuðum insúlín nanóagnum, voru aðeins frostþurrkaðar, úðaþurrkaðar og mannitóllausar nanóagnir notaðar í endurgerðartilraunum og mannitóllausar nanóagnir vegna niðurbrots mannitóllausra nanóagna við ofþornun. Rætt er.
Þurrkun er notuð til langtímageymslu og endurvinnslu í aðrar samsetningar. Hæfni þurrra nanópartíkla til að endurmyndast eftir geymslu er mikilvæg fyrir notkun þeirra í mismunandi samsetningar eins og töflur og filmur. Við tókum eftir því að meðal agnastærð úðaþurrkuðu insúlín nanópartíkla án mannítóls jókst aðeins lítillega eftir endurblöndun. Hins vegar jókst agnastærð úðaþurrkuðu og frostþurrkuðu insúlín nanópartíkla með mannítóli verulega (Tafla 1). PDI og EE breyttust ekki marktækt (p > 0,05) eftir endurröðun allra nanópartíkla í þessari rannsókn (Tafla 1). Þessi niðurstaða bendir til þess að flestar agnirnar héldust óbreyttar eftir endurupplausn. Hins vegar leiddi viðbót mannítóls til mjög minnkaðs insúlínmagns í frostþurrkuðum og úðaþurrkuðum mannítól nanópartíklum (Tafla 1). Aftur á móti var insúlínmagn úðaþurrkuðu nanópartíkla án mannítóls það sama og áður (Tafla 1).
Það er vel þekkt að hleðsla nanóagna er mikilvæg þegar þær eru notaðar til lyfjagjafar. Fyrir nanóagnir með lága hleðslu þarf mjög mikið magn af efni til að ná meðferðarþröskuldi. Hins vegar leiðir mikil seigja slíkrar mikils nanóagnaþéttni til óþæginda og erfiðleika við inntöku og stungulyfja, hver um sig 22. Að auki er einnig hægt að nota insúlín-nanóagnir til að búa til töflur og seigfljótandi líffilmur 23, 24, sem krefst notkunar mikils magns af nanóagnum við lága hleðslu, sem leiðir til stórra taflna og þykkra líffilma sem henta ekki til inntöku. Þess vegna eru þurrkuð nanóagnir með mikilli insúlínhleðslu mjög eftirsóknarverðar. Niðurstöður okkar benda til þess að mikil insúlínhleðsla mannítóllausra úðaþurrkuðra nanóagna geti boðið upp á marga aðlaðandi kosti fyrir þessar aðrar afhendingaraðferðir.
Allar þurrkuðu nanóagnirnar voru geymdar í kæli í þrjá mánuði. Niðurstöður úr rafeindasmárannsókn (SEM) sýndu að formgerð allra þurrkuðu nanóagnanna breyttist ekki marktækt á þriggja mánaða geymslutímanum (Mynd 4). Eftir blöndun í vatni sýndu allar nanóagnirnar lítilsháttar minnkun á EE og losuðu um það bil lítið magn (~5%) af insúlíni á þriggja mánaða geymslutímanum (Tafla 2). Hins vegar jókst meðal agnastærð allra nanóagna. Agnastærð nanóagna sem voru úðaþurrkaðar án mannítóls jókst í 525 nm, en agnastærð úðaþurrkaðra og frystþurrkaðra nanóagna með mannítóli jókst í 872 og 921 nm, talið í sömu röð (Tafla 2).
Formgerð mismunandi þurrkaðra insúlín-nanóagna sem geymdar voru í þrjá mánuði: (a) SEM mynd af frostþurrkuðum insúlín-nanóögnum með mannitóli; (b) SEM mynd af úðaþurrkuðum insúlín-nanóögnum án mannitóls; (c) SEM myndir af úðaþurrkuðum insúlín-nanóögnum án mannitóls.
Ennfremur sáust útfellingar í endurbyggðum insúlínnanóögnum sem höfðu verið úðaþurrkaðar með mannítóli og frystþurrkaðar (Mynd S2). Þetta gæti stafað af því að stórar agnir sviflausnuðu ekki rétt í vatninu. Allar ofangreindar niðurstöður sýna að úðaþurrkunartæknin getur verndað insúlínnanóagnir gegn ofþornun og að hægt er að fá mikið magn af insúlínnanóögnum án fylliefna eða frostvarnarefna.
Insúlínheldni var prófuð í pH = 2,5 miðli með pepsíni, trypsíni og α-kýmótrýpsíni til að sýna fram á verndandi getu nanóagna gegn ensímmeltingu eftir ofþornun. Insúlínheldni þurrkaðra nanóagna var borin saman við insúlínheldni nýlagaðra nanóagna og frítt insúlín var notað sem neikvæð samanburðarpróf. Í þessari rannsókn sýndi frítt insúlín hraða insúlínbrottskilnað innan 4 klst. í öllum þremur ensímmeðferðunum (Mynd 5a-c). Aftur á móti sýndu insúlínbrottskilnaðarprófanir á frystþurrkuðum nanóagnum með mannítóli og úðaþurrkuðum nanóagnum með eða án mannítóls marktækt meiri vernd þessara nanóagna gegn ensímmeltingu, sem var svipuð og hjá nýlöguðum insúlín-nanóagnum (Mynd 1).5a-c). Með hjálp nanóagna í pepsíni, trypsíni og α-kýmótrýpsíni var hægt að vernda meira en 50%, 60% og 75% af insúlíni innan 4 klst., talið í sömu röð (Mynd 5a-c). Þessi insúlínverndandi getu gæti aukið líkurnar á meiri insúlínfrásogi. út í blóðrásina25. Þessar niðurstöður benda til þess að úðaþurrkun með eða án mannitóls og frystþurrkun með mannitóli geti varðveitt insúlínverndandi getu nanópróteina eftir ofþornun.
Vernd og losunarhegðun þurrkaðra insúlín-nanoprótínprótíns: (a) vernd insúlíns í pepsínlausn; (b) vernd insúlíns í trypsínlausn; (c) vernd insúlíns með α-kýmótrypsínlausn; (d) Losunarhegðun þurrkaðra nanopartíkla í lausn með pH 2,5; (e) losunarhegðun þurrkaðra nanopartíkla í lausn með pH 6,6; (f) losunarhegðun þurrkaðra nanopartíkla í lausn með pH 7,0.
Nýbúnar og enduruppbyggðar þurrar insúlín-nanosporínur voru ræktaðar í ýmsum stuðpúðum (pH = 2,5, 6,6, 7,0) við 37°C, til að herma eftir pH-umhverfi maga, skeifugörnar og efri hluta smáþarma, til að kanna áhrif insúlíns á insúlínviðnám. Losunarhegðun í mismunandi umhverfi. Brot úr meltingarvegi. Við pH = 2,5 sýndu insúlínhlaðnar nanóagnir og endurleystar þurrar insúlín-nanóagnir upphaflega losun innan fyrstu klukkustundarinnar, og síðan hægfara losun næstu 5 klukkustundirnar (Mynd 5d). Þessi hraða losun í upphafi er líklega afleiðing af hraðri yfirborðsfrásogs próteinsameinda sem eru ekki að fullu festar í innri uppbyggingu agnarinnar. Við pH = 6,5 sýndu insúlínhlaðnar nanóagnir og endurbyggðar þurrar insúlín-nanóagnir mjúka og hægfara losun yfir 6 klst., þar sem pH prófunarlausnarinnar var svipað og í lausninni sem var útbúin með nanóagnum (Mynd 5e). Við pH = 7 voru nanóagnir óstöðugar og brotnuðu næstum alveg niður innan fyrstu tveggja klukkustunda (Mynd 5f). Þetta er vegna þess að afrótónun kítósans á sér stað við hærra pH, sem leiðir til minna þétts fjölliðunetkerfis og losunar á hlaðnu insúlíni.
Ennfremur sýndu insúlín-nanopartíkurnar sem voru úðaþurrkaðar án mannítóls hraðari losun en aðrar þurrkaðar insúlín-nanopartíkurnar (Mynd 5d–f). Eins og áður hefur verið lýst sýndu endurbyggðar insúlín-nanopartíkurnar sem voru þurrkaðar án mannítóls minnstu agnastærðina. Lítil agnir veita stærra yfirborðsflatarmál, þannig að megnið af viðkomandi lyfi verður á eða nálægt agnayfirborðinu, sem leiðir til hraðrar losunar lyfsins26.
Frumueituráhrif nanóagna voru rannsökuð með MTT prófi. Eins og sést á mynd S4, reyndust allar þurrkuðu nanóagnsýrurnar ekki hafa marktæk áhrif á frumulifun við styrk upp á 50–500 μg/ml, sem bendir til að allar þurrkuðu nanóagnsýrurnar megi nota á öruggan hátt til að ná meðferðarglugganum.
Lifrin er aðallíffærið þar sem insúlín gegnir lífeðlisfræðilegum hlutverkum sínum. HepG2 frumur eru lifraræxlisfrumulína manna sem almennt er notuð sem in vitro upptökulíkan fyrir lifrarfrumur. Hér voru HepG2 frumur notaðar til að meta frumuupptöku á þurrkuðum nanópróteinum með frostþurrkunar- og úðaþurrkunaraðferðum. Frumuupptaka með confocal leysigeislaskönnun með flæðifrumusjá og sjónrænni skoðun eftir nokkurra klukkustunda ræktun með fríu FITC insúlíni í styrk 25 μg/ml, nýtilbúnum FITC insúlínhlaðnum nanópróteinum og þurrkuðum FITC insúlínhlaðnum nanópróteinum við jöfn insúlínstyrk. Megindlegar smásjárathuganir (CLSM) voru gerðar. Frostþurrkaðar nanóprótein án mannítóls eyðilögðust við ofþornun og voru ekki metnar í þessari prófun. Innanfrumuflúrljómunarstyrkur nýtilbúinna insúlínhlaðinna nanópróteina, frostþurrkaðra nanópróteina með mannítóli og úðaþurrkaðra nanópróteina með og án mannítóls (Mynd 6a) var 4,3, 2,6, 2,4 og 4,1 sinnum hærri en þeirra fríu. FITC-insúlín hópnum, talið í sömu röð (Mynd 6b). Þessar niðurstöður benda til þess að innhýst insúlín sé öflugra í frumuupptöku en frítt insúlín, aðallega vegna minni stærðar insúlínhlaðinna nanóagna sem framleiddar voru í rannsókninni.
Upptaka HepG2 frumna eftir 4 klst. ræktun með nýútbúnum NP og þurrkuðum NP: (a) Dreifing FITC-insúlínupptöku hjá HepG2 frumum. (b) Rúmfræðilegt meðaltal flúrljómunarstyrkleika greint með flæðifrumusjá (n = 3), *P < 0,05 samanborið við frítt insúlín.
Á sama hátt sýndu CLSM myndirnar að FITC flúrljómunarstyrkur nýlagaðra FITC-insúlínhlaðinna nanópartíkla og FITC-insúlínhlaðinna úðaþurrkaðra nanópartíkla (án mannitóls) var mun sterkari en í hinum sýnunum (Mynd 6a). Ennfremur, með viðbættu mannitóli, jók hærri seigja lausnarinnar viðnám gegn frumuupptöku, sem leiddi til minnkaðrar insúlínfjölgunar. Þessar niðurstöður benda til þess að mannitóllausar úðaþurrkuð nanópartíklar sýndu mesta frumuupptökuhagkvæmni vegna þess að agnastærð þeirra var minni en frystþurrkuðra nanópartíkla eftir endurupplausn.
Kítósan (meðalmólþungi 100 kDa, 75–85% afasetýlerað) var keypt frá Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Kanada). Natríumtrípólýfosfat (TPP) var keypt frá VWR (Radnor, Pennsylvaníu, Bandaríkjunum). Raðbrigða mannainsúlín sem notað var í þessari rannsókn var frá Fisher Scientific (Waltham, MA, Bandaríkjunum). Flúoreseínísóþíósýanat (FITC)-merkt mannainsúlín og 4′,6-díamídínó-2-fenýlindóldíhýdróklóríð (DAPI) voru keypt frá Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Kanada). HepG2 frumulínan var fengin frá ATCC (Manassas, Virginíu, Bandaríkjunum). Öll önnur hvarfefni voru af greiningar- eða litskiljunargráðu.
Útbúið 1 mg/ml CS lausn með því að leysa hana upp í tvöföldu eimuðu vatni (DD vatni) sem inniheldur 0,1% ediksýru. Útbúið 1 mg/ml lausnir af TPP og insúlíni með því að leysa þær upp í DD vatni og 0,1% ediksýru, talið í sömu röð. Forfleytið var útbúið með polytron PCU-2-110 hraðjöfnunartæki (Brinkmann Ind. Westbury, NY, Bandaríkjunum). Undirbúningsferlið er sem hér segir: fyrst eru 2 ml af TPP lausn bætt út í 4 ml af insúlínlausn og blandan er hrærð í 30 mínútur og blandað vel saman. Síðan var blönduðu lausninni bætt dropavis út í CS lausnina með sprautu undir hræringu á miklum hraða (10.000 snúninga á mínútu). Blöndunum var haldið undir hræringu á miklum hraða (15.000 snúninga á mínútu) í ísbaði í 30 mínútur og þær voru stilltar á ákveðið pH til að fá þverbundnar insúlín nanopartíklar. Til að jafna enn frekar og minnka agnastærð insúlín nanopartíkla voru þær hljóðbeittar í ... í 30 mínútur til viðbótar í ísbaði með ómskoðunartæki af mæligerð (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Þýskalandi).
Insúlín-NPS voru prófuð fyrir Z-meðalþvermál, fjöldreifistuðul (PDI) og zeta-möguleika með því að nota mælingar á kraftmikilli ljósdreifingu (DLS) með því að nota Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Austurríki) með því að þynna þau í DD-vatni við 25°C. Formgerð og stærðardreifing voru einkennd með Hitachi H7600 rafeindasmásjá (TEM) (Hitachi, Tókýó, Japan) og myndirnar voru síðan greindar með Hitachi myndgreiningarhugbúnaði (Hitachi, Tókýó, Japan). Til að meta innhyllunarhagkvæmni (EE) og hleðslugetu (LC) insúlín-NPs voru NPs settar með pípettu í öfgasíunarrör með mólþyngdarmörkum upp á 100 kDa og skilvindar við 500 xg í 30 mínútur. Óinnhylkt insúlín í síuvökvanum var magngreint með Agilent 1100 Series HPLC kerfi (Agilent, Santa Clara, Kaliforníu, Bandaríkjunum) sem samanstóð af fjórðungsdælu, sjálfvirkum sýnatökubúnaði, súluhitara og DAD. skynjari. Insúlín var greint með C18 dálki (Zorbax, 3,5 μm, 4,6 mm × 150 mm, Agilent, Bandaríkin) og mældur við 214 nm. Færanlega fasinn var asetónítríl og vatn, sem innihélt 0,1% TFA, hallahlutföll frá 10/90 til 100/0, og keyrt í 10 mínútur. Færanlega fasinn var dæltur með rennslishraða 1,0 ml/mín. Hitastig dálksins var stillt á 20°C. Reiknaðu prósentur EE og LC með því að nota jöfnur (1) og jöfnu (2).
Ýmsar CS/insúlín hlutföll á bilinu 2,0 til 4,0 voru prófuð til að hámarka insúlín nanóagnir. Mismunandi magn af CS lausn var bætt við við undirbúninginn, en insúlín/TPP blandan var haldið stöðug. Insúlín nanóagnir voru útbúnar við pH bilið 4,0 til 6,5 með því að stjórna pH blöndunnar vandlega eftir að allar lausnir (insúlín, TPP og CS) voru bættar við. EE og agnastærð insúlín nanóagna voru metin við mismunandi pH gildi og CS/insúlín massahlutföll til að hámarka myndun insúlín nanóagna.
Bestu insúlín-nanosporínin voru sett á álílátið og þakið með pappír og hert með límbandi. Því næst voru skrúfuðu ílátin sett í Labconco FreeZone frystiþurrkara (Labconco, Kansas City, MO, Bandaríkin) sem var búinn bakkaþurrkara. Hitastig og lofttæmisþrýstingur voru stilltir á -10°C, 0,350 Torr fyrstu 2 klst. og síðan 0°C og 0,120 Torr næstu 22 klst. af 24 klst. til að fá þurrar insúlín-nanosporínur.
Buchi Mini Spray Dryer B-290 (BÜCHI, Flawil, Sviss) var notaður til að framleiða innhýst insúlín. Valdar þurrkunarbreytur voru: hitastig 100 °C, fóðurflæði 3 l/mín. og gasflæði 4 l/mín.
Insúlín nanóagnir fyrir og eftir ofþornun voru einkenndar með FTIR-ATR litrófsgreiningu. Ofþornaðar nanóagnir ásamt fríu insúlíni og kítósani voru greind með Spectrum 100 FTIR litrófsmæli (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, Bandaríkjunum) sem var búinn alhliða ATR sýnatökubúnaði (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, Bandaríkjunum). Meðalgildi merkja fengust úr 16 skönnunum með 4 cm2 upplausn á tíðnibilinu 4000-600 cm2.
Formgerð þurrra insúlín-nanoprótana var metin með rafeindasmásjá (SEM) myndum af frystþurrkuðum og úðaþurrkuðum insúlín-nanoprótum sem teknar voru með Helios NanoLab 650 Focused Ion Beam-Scanning Electron Microscope (FIB-SEM) (FEI, Hillsboro, Oregon, Bandaríkjunum). Helsta færibreytan sem notuð var var spenna 5 keV og straumur 30 mA.
Öllum þurrkuðum insúlín-nanopróteinum var leyst upp aftur í þurrkaðu vatni. Agnastærð, PDI, EE og LC voru prófuð aftur með sömu aðferð og áður var nefnd til að meta gæði þeirra eftir þurrkun. Stöðugleiki anhýdróinsúlín-nanopróteina var einnig mældur með því að prófa eiginleika nanopartíkanna eftir langvarandi geymslu. Í þessari rannsókn voru öll nanopartík eftir þurrkun geymd í kæli í þrjá mánuði. Eftir þriggja mánaða geymslu voru nanopartíkurnar prófaðar með tilliti til formfræðilegrar agnastærðar, PDI, EE og LC.
Leysið 5 ml af endurbyggðum nanópróteinum upp í 45 ml af magavökva (pH 1,2, sem inniheldur 1% pepsín), þarmavökva (pH 6,8, sem inniheldur 1% trypsín) eða kímótrypsínlausn (100 g/ml, í fosfatjafnalausn, pH 7,8) til að meta virkni insúlíns við að vernda nanóprótein eftir ofþornun. Þeim var komið fyrir við 37°C með hrærihraða 100 snúninga á mínútu. 500 μL af lausninni voru safnað á mismunandi tímapunktum og insúlínstyrkurinn var ákvarðaður með háþrýstingsvökvaskiljun.
Losunarhegðun nýlagaðra og þurrkaðra insúlín-nanopartíkla in vitro var prófuð með skilunarpokaaðferðinni (sameindaþyngdarmörk 100 kDa, Spectra Por Inc.). Nýlagaðar og endurgerðar þurrar nanopartíklar voru skilaðar í vökva við pH 2,5, pH 6,6 og pH 7,0 (0,1 M fosfat-buffarað saltvatn, PBS) til að líkja eftir pH umhverfi maga, skeifugörn og efri hluta smáþarma, talið í sömu röð. Öll sýni voru ræktuð við 37°C með stöðugum hristingi við 200 snúninga á mínútu. Sogið vökvann út fyrir 5 ml skilunarpokann á eftirfarandi tímum: 0,5, 1, 2, 3, 4 og 6 klst. og fyllið strax á rúmmálið með fersku skilunarvökva. Insúlínmengun í vökvanum var greind með HPLC og hraði insúlínlosunar úr nanóögnunum var reiknaður út frá hlutfalli frís insúlíns sem losnaði miðað við heildarinsúlín sem var innlimað í nanóögnunum (jafna 3).
HepG2 frumur úr lifrarfrumukrabbameini manna voru ræktaðar í 60 mm þvermál skálum með því að nota Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) sem innihélt 10% fósturkúasermi, 100 IU/ml penisillín og 100 μg/ml streptómýsín29. Ræktunin var haldin við 37°C, 95% rakastig og 5% CO2. Fyrir upptökuprófanir voru HepG2 frumur sáðar í 1 × 105 frumur/ml á 8-hols Nunc Lab-Tek hólfsglerjakerfi (Thermo Fisher, NY, Bandaríkin). Fyrir frumudrepandi prófanir voru þær sáðar í 96-hols plötur (Corning, NY, Bandaríkin) í þéttleikanum 5 × 104 frumur/ml.
MTT prófið var notað til að meta frumudrepandi áhrif nýlagaðra og þurrkuðra insúlín NPs30. HepG2 frumur voru sáðar í 96 hols plötur með þéttleikanum 5 × 104 frumur/ml og ræktaðar í 7 daga fyrir prófun. Insúlín NPs voru þynntar í mismunandi styrk (50 til 500 μg/ml) í ræktunarmiðli og síðan gefnar frumunum. Eftir 24 klukkustunda ræktun voru frumurnar þvegnar 3 sinnum með PBS og ræktaðar með miðli sem innihélt 0,5 mg/ml MTT í 4 klukkustundir til viðbótar. Frumudrepandi áhrif voru metin með því að mæla ensímfræðilega afoxun guls tetrazólíum MTT í fjólublátt formazan við 570 nm með því að nota Tecan infinite M200 pro litrófsmæliplötulesara (Tecan, Männedorf, Sviss).
Upptökuhagkvæmni NPs í frumum var prófuð með confocal leysigeislaskönnunarsmásjá og flæðifrumusjárgreiningu. Hver hola í Nunc Lab-Tek hólfsglerjakerfinu var meðhöndluð með fríu FITC-insúlíni, FITC-insúlínhlaðnum NPs og 25 μg/ml af þurrkuðum FITC-insúlín NPs endurbyggð í sama styrk og ræktuð í 4 klukkustundir. Frumur voru þvegnar 3 sinnum með PBS og festar með 4% paraformaldehýði. Kjarnar voru litaðir með 4′,6-díamídínó-2-fenýlindóli (DAPI). Staðsetning insúlíns var athuguð með Olympus FV1000 leysigeislaskönnunar-/tveggja-ljóseinda confocal smásjá (Olympus, Shinjuku City, Tókýó, Japan). Fyrir flæðifrumusjárgreiningu voru sömu styrkleikar af 10 μg/ml fríu FITC-insúlíni, FITC-insúlínhlaðnum NPs og enduruppleystum þurrkuðum FITC-insúlín NPs bætt við 96 hola plötur sáðar með HepG2 frumum og ræktaðar í 4 klukkustundir. klukkustundir. Eftir 4 klst. ræktun voru frumurnar fjarlægðar og þvegnar 3 sinnum með FBS. 5 × 104 frumur í hverju sýni voru greindar með BD LSR II flæðifrumumæli (BD, Franklin Lakes, New Jersey, Bandaríkin).
Öll gildi eru gefin upp sem meðaltal ± staðalfrávik. Samanburður milli allra hópa var metinn með einhliða ANOVA eða t-prófi með IBM SPSS Statistics 26 fyrir Mac (IBM, Endicott, New York, Bandaríkjunum) og p < 0,05 var talið tölfræðilega marktækt.
Þessi rannsókn sýnir fram á sveigjanleika og getu úðaþurrkunar til að þurrka þverbundnar kítósan/TPP/insúlín nanóagnir með betri endurupplausn samanborið við venjulegar frostþurrkunaraðferðir sem nota fylliefni eða frostvarnarefni og meiri burðargetu. Bættar insúlín nanóagnir gáfu meðal agnastærð upp á 318 nm og innhyllunarvirkni upp á 99,4%. Niðurstöður SEM og FTIR eftir þurrkun sýndu að kúlulaga uppbyggingin var aðeins viðhaldið í úðaþurrkuðum nanóagnum með og án mannitóls og frostþurrkuðum með mannitóli, en frostþurrkuð nanóagnir án mannitóls brotnuðu niður við þurrkun. Í endurupplausnarprófinu sýndu insúlín nanóagnir sem voru úðaþurrkuð án mannitóls minnstu meðal agnastærðina og mestu hleðsluna við endurupplausn. Losunarhegðun allra þessara þurrkuðu nanóagna sýndi að þær losnuðu hratt í lausnum með pH = 2,5 og pH = 7, og voru mjög stöðugar í lausn með pH = 6,5. Í samanburði við aðrar enduruppleystar, þurrkuð nanóagnir, voru nanóagnirnar... Úðþurrkuð nanóagnir án mannítóls losnuðu hraðast. Þessi niðurstaða er í samræmi við það sem kom fram í frumuupptökuprófinu, þar sem úðþurrkuð nanóagnir án mannítóls viðhéldu næstum að fullu frumuupptökuhagkvæmni nýlagaðra nanóagna. Þessar niðurstöður benda til þess að þurrar insúlínnanóagnir sem búnar eru til með mannítóllausri úðþurrkun henti best til frekari vinnslu í önnur vatnsfrí skammtaform, svo sem töflur til inntöku eða lífrænt viðloðandi filmur.
Vegna hugverkaréttinda eru gagnasöfnin sem voru búin til og/eða greind í þessari rannsókn ekki aðgengileg opinberlega, en eru tiltæk frá viðkomandi höfundum ef óskað er eftir þeim á sanngjarnan hátt.
Kagan, A. Sykursýki af tegund 2: félagslegur og vísindalegur uppruni, læknisfræðilegir fylgikvillar og áhrif á sjúklinga og aðra. (McFarlane, 2009).
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. & Jiang, P. Þróun insúlínhjúpunar: er inntöku lyfja nú mögulegt? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. & Dass, CR Nýlegar framfarir í lípósómgjöfarkerfum til inntöku með insúlíni til meðferðar á sykursýki. Túlkun. J. Pharmacy. 549, 201–217 (2018).