Greinin er hluti af rannsóknarefninu „Að bæta viðnám belgjurta gegn sýklum og meindýrum“, sjá allar 5 greinarnar.
Orsök sveppasjúkdómsins dreps í plöntum, Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, notar margþætta aðferð til að smita mismunandi hýsilplöntur. Þessi rannsókn leggur til notkun díamínsins L-ornitíns, amínósýra sem er ekki prótein og örvar myndun annarra nauðsynlegra amínósýra, sem valkosta við meðferð til að auka sameinda-, lífeðlisfræðileg og lífefnafræðileg viðbrögð Phaseolus vulgaris L. við hvítmyglu af völdum Pseudomonas sclerotiorum. Tilraunir in vitro sýndu að L-ornitín hamlaði verulega sveppavöxt S. pyrenoidosa á skammtaháðan hátt. Þar að auki gæti það dregið verulega úr alvarleika hvítmyglu við gróðurhúsaaðstæður. Ennfremur örvaði L-ornitín vöxt meðhöndlaðra plantna, sem bendir til þess að prófaðir styrkir L-ornitíns voru ekki plöntueituráhrif fyrir meðhöndlaðar plöntur. Að auki jók L-ornitín tjáningu andoxunarefna sem ekki eru ensímtengd (heildarleysanleg fenól og flavonoíð) og ensímbundinna andoxunarefna (katalasa (CAT), peroxidasa (POX) og pólýfenóloxídasa (PPO)) og jók tjáningu þriggja gena sem tengjast andoxunarefnum (PvCAT1, PvSOD og PvGR). Ennfremur leiddi in silico greining í ljós tilvist hugsanlegs oxaloacetat asetýlhýdrólasa (SsOAH) próteins í erfðamengi S. sclerotiorum, sem var mjög svipað oxaloacetat asetýlhýdrólasa (SsOAH) próteinum Aspergillus fijiensis (AfOAH) og Penicillium sp. (PlOAH) hvað varðar virknigreiningu, varðveitt lén og staðsetningu. Athyglisvert er að viðbót L-ornitíns við kartöfludextrósa seyði (PDB) miðil minnkaði verulega tjáningu SsOAH gensins í S. sclerotiorum sveppþráðum. Á sama hátt minnkaði utanaðkomandi notkun L-ornitíns marktækt tjáningu SsOAH gensins í sveppaþráðum sem safnað var úr meðhöndluðum plöntum. Að lokum minnkaði notkun L-ornitíns marktækt oxalsýruseytingu bæði í PDB ræktunarmiðli og sýktum laufblöðum. Að lokum gegnir L-ornitín lykilhlutverki í að viðhalda oxunar-afoxunarstöðu sem og að auka varnarviðbrögð sýktra plantna. Niðurstöður þessarar rannsóknar gætu hjálpað til við að þróa nýstárlegar, umhverfisvænar aðferðir til að stjórna hvítmyglu og draga úr áhrifum hennar á baunarækt og aðrar nytjaplöntur.
Hvítmygla, af völdum drepsveppsins Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, er skelfilegur sjúkdómur sem hefur í för með sér minnkandi uppskeru og er alvarleg ógn við ræktun bauna (Phaseolus vulgaris L.) um allan heim (Bolton o.fl., 2006). Sclerotinia sclerotiorum er einn erfiðasti jarðvegsborni sveppasjúkdómurinn til að stjórna, með fjölbreytt úrval af hýsiltegundum sem telur yfir 600 plöntur og getu til að leysa upp vefi hýsilsins hratt á ósértækan hátt (Liang og Rollins, 2018). Við óhagstæðar aðstæður fer hún í gegnum mikilvægt skeið í lífsferli sínum, þar sem hún liggur í dvala í langan tíma sem svartar, harðar, frælíkar strúktúrar sem kallast „sklerotía“ í jarðveginum eða sem hvítir, loðnir vextir í sveppþráðum eða stilkmergi sýktra plantna (Schwartz o.fl., 2005). S. sclerotiorum er fær um að mynda hörpusveppi, sem gerir henni kleift að lifa af á sýktum ökrum í langan tíma og haldast við sjúkdóma (Schwartz o.fl., 2005). Hörpusveppir eru ríkir af næringarefnum, geta lifað í jarðveginum í langan tíma og þjónað sem aðalbóluefni fyrir síðari sýkingar (Schwartz o.fl., 2005). Við hagstæðar aðstæður spíra hörpusveppir og framleiða loftborn gró sem geta sýkt alla ofanjarðarhluta plöntunnar, þar á meðal en ekki takmarkað við blóm, stilka eða fræbelgi (Schwartz o.fl., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum notar margþætta aðferð til að sýkja hýsilplöntur sínar, sem felur í sér röð samhæfðra atburða, allt frá spírun hörðnunar til einkennamyndunar. Í upphafi framleiðir S. sclerotiorum svifgró (kölluð askogró) úr sveppalíkum strúktúrum sem kallast apótecia, sem berast í loftið og þróast í óhreyfanlega hörðnunargró á sýktum plöntuleifum (Bolton o.fl., 2006). Sveppurinn seytir síðan oxalsýru, sem er sýkingarþáttur, til að stjórna sýrustigi frumuveggja plantna, stuðla að ensímniðurbroti og vefjainnrás (Hegedus og Rimmer, 2005) og bæla oxunarsprengingu hýsilplöntunnar. Þetta sýrumyndunarferli veikir frumuvegginn og veitir hagstætt umhverfi fyrir eðlilega og skilvirka starfsemi frumuveggnýrandi ensíma sveppa (CWDE), sem gerir sýklinum kleift að yfirstíga líkamlega hindrunina og komast inn í vefi hýsilsins (Marciano o.fl., 1983). Þegar S. sclerotiorum hefur komist í gegnum sýkta vefi seytir það fjölda CWDE-próteina, svo sem pólýgalaktúrónasa og sellulasa, sem auðvelda dreifingu þess í sýktum vefjum og valda vefjadrepi. Framvinda meinsemda og vefjasveppamottna leiðir til einkennandi einkenna hvítmyglu (Hegedus og Rimmer, 2005). Á sama tíma þekkja hýsilplöntur sýklatengd sameindamynstur (PAMPs) í gegnum mynsturþekkingarviðtaka (PRRs), sem hrinda af stað röð boðleiða sem að lokum virkja varnarviðbrögð.
Þrátt fyrir áratuga viðleitni til að stjórna sjúkdómum er enn skortur á fullnægjandi ónæmum kímplasma í baunum, eins og í öðrum nytjajurtum, vegna ónæmis, lifunar og aðlögunarhæfni sýkilsins. Meðferð sjúkdómsins er því afar krefjandi og krefst samþættrar, fjölþættrar stefnu sem felur í sér blöndu af ræktunaraðferðum, líffræðilegri stjórnun og efnafræðilegum sveppalyfjum (O'Sullivan o.fl., 2021). Efnafræðileg stjórnun á hvítmyglu er áhrifaríkust því sveppalyf, þegar þau eru notuð rétt og á réttum tíma, geta á áhrifaríkan hátt stjórnað útbreiðslu sjúkdómsins, dregið úr alvarleika sýkingarinnar og lágmarkað uppskerutap. Hins vegar getur ofnotkun og of mikil notkun sveppalyfja leitt til þess að ónæm stofna af S. sclerotiorum myndast og haft neikvæð áhrif á lífverur utan markhóps, jarðvegsheilsu og vatnsgæði (Le Cointe o.fl., 2016; Ceresini o.fl., 2024). Því hefur það orðið forgangsverkefni að finna umhverfisvæna valkosti.
Pólýamín (PA), svo sem pútresín, spermidín, spermín og kadaverín, geta verið efnilegir kostir gegn jarðvegsbornum plöntusjúkdómsvöldum og þannig dregið að hluta eða alveg úr notkun hættulegra sveppalyfja (Nehela o.fl., 2024; Yi o.fl., 2024). Í háplöntum taka PA þátt í mörgum lífeðlisfræðilegum ferlum, þar á meðal en ekki takmarkað við frumuskiptingu, sérhæfingu og svörun við ólífrænum og lífrænum álagi (Killiny og Nehela, 2020). Þau geta virkað sem andoxunarefni, hjálpað til við að binda hvarfgjörn súrefnistegund (ROS), viðhalda oxunar-afoxunarjafnvægi (Nehela og Killiny, 2023), örvað varnartengd gen (Romero o.fl., 2018), stjórnað ýmsum efnaskiptaferlum (Nehela og Killiny, 2023), haft áhrif á innræn plöntuhormón (Nehela og Killiny, 2019), komið á fót kerfisbundnu áunnu ónæmi (SAR) og stjórnað víxlverkunum plantna og sýkla (Nehela og Killiny, 2020; Asija o.fl., 2022; Czerwoniec, 2022). Það er vert að taka fram að sértækir verkunarháttir og hlutverk PA í vörn plantna eru mismunandi eftir tegundum, sýklum og umhverfisaðstæðum. Algengasta PA í plöntum er myndað úr nauðsynlega pólýamíninu L-ornitíni (Killiny og Nehela, 2020).
L-ornitín gegnir mörgum hlutverkum í vexti og þroska plantna. Til dæmis hafa fyrri rannsóknir sýnt að í hrísgrjónum (Oryza sativa) gæti ornitín tengst endurvinnslu köfnunarefnis (Liu o.fl., 2018), uppskeru, gæðum og ilm hrísgrjóna (Lu o.fl., 2020) og vatnsálagi (Yang o.fl., 2000). Ennfremur jók utanaðkomandi notkun L-ornitíns verulega þurrkaþol í sykurrófum (Beta vulgaris) (Hussein o.fl., 2019) og dró úr saltálagi í laukplöntum (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu og Çavuşoǧlu, 2021) og kasjúhnetuplöntum (Anacardium occidentale) (da Rocha o.fl., 2012). Hugsanlegt hlutverk L-ornitíns í vörn gegn ólífrænu álagi gæti stafað af þátttöku þess í uppsöfnun prólíns í meðhöndluðum plöntum. Til dæmis hefur áður verið greint frá því að gen sem tengjast prólínumbrotum, svo sem ornitín delta amínótransferasi (delta-OAT) og prólín dehýdrógenasi (ProDH1 og ProDH2) gen, taki þátt í vörn Nicotiana benthamiana og Arabidopsis thaliana gegn Pseudomonas syringae stofnum sem ekki eru hýsill (Senthil-Kumar og Mysore, 2012). Hins vegar er ornitín dekarboxýlasi (ODC) sveppa nauðsynlegur fyrir vöxt sýkla (Singh o.fl., 2020). Að beina ODC á Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici með genaþöggun hýsils (HIGS) jók verulega viðnám tómatplantna gegn visnun (Singh o.fl., 2020). Hins vegar hefur mögulegt hlutverk utanaðkomandi ornitínnotkunar gegn líffræðilegum streituvöldum eins og plöntusjúkdómum ekki verið vel rannsakað. Mikilvægara er að áhrif orniþíns á sjúkdómsþol og tengd lífefnafræðileg og lífeðlisfræðileg fyrirbæri eru enn að mestu órannsökuð.
Að skilja flækjustig S. sclerotiorum sýkingar í belgjurtum er mikilvægt til að þróa árangursríkar stjórnunaraðferðir. Í þessari rannsókn var markmiðið að bera kennsl á mögulegt hlutverk díamínsins L-ornitíns sem lykilþáttar í að efla varnarkerfi og viðnám belgjurta gegn Sclerotinia sclerotiorum sýkingu. Við gerum ráð fyrir að auk þess að auka varnarviðbrögð sýktra plantna gegni L-ornitín einnig lykilhlutverki í að viðhalda oxunar-afoxunarstöðu. Við leggjum til að hugsanleg áhrif L-ornitíns tengist stjórnun á ensímvirkum og óensímvirkum andoxunarefnum og truflun á sjúkdómsvaldandi/eiturvirkni sveppa og tengdum próteinum. Þessi tvöfalda virkni L-ornitíns gerir það að efnilegum frambjóðanda fyrir sjálfbæra stefnu til að draga úr áhrifum hvítmyglu og auka viðnám algengra belgjurta gegn þessum öfluga sveppasjúkdómsvaldi. Niðurstöður þessarar rannsóknar gætu hjálpað til við þróun nýstárlegra, umhverfisvænna aðferða til að stjórna hvítmyglu og draga úr áhrifum hennar á framleiðslu belgjurta.
Í þessari rannsókn var notað viðkvæmt afbrigði af almennri baun, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), sem tilraunaefni. Heilbrigð fræ voru vinsamlega veitt af rannsóknardeild belgjurta, rannsóknarstofnun fyrir akurrækt (FCRI), rannsóknarmiðstöð landbúnaðarins (ARC) í Egyptalandi. Fimm fræ voru sáð í plastpotta (innra þvermál 35 cm, dýpt 50 cm) fyllta með jarðvegi sýktum af S. sclerotiorum við gróðurhúsaaðstæður (25 ± 2 °C, rakastig 75 ± 1%, 8 klst. ljós/16 klst. myrkur). 7–10 dögum eftir sáningu (DPS) voru spírurnar þynntar þannig að aðeins tvær spírur með jafnvexti og þrjú fullþróuð laufblöð voru eftir í hverjum potti. Allar pottaplöntur voru vökvaðar á tveggja vikna fresti og áburðargefnar mánaðarlega samkvæmt ráðlögðum hraða fyrir viðkomandi afbrigði.
Til að útbúa 500 mg/L styrk af L-ornitínedíamíni (einnig þekkt sem (+)-(S)-2,5-díamínópentansýra; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Þýskalandi) voru 50 mg fyrst leyst upp í 100 ml af dauðhreinsuðu eimuðu vatni. Stofnlausnin var síðan þynnt og notuð í síðari tilraunum. Í stuttu máli voru sex seríur af L-ornitínstyrkjum (12,5, 25, 50, 75, 100 og 125 mg/L) prófaðar in vitro. Að auki var dauðhreinsað eimað vatn notað sem neikvæð viðmiðun (Mock) og sveppaeyðirinn „Rizolex-T“ 50% vætanlegur duft (tóklófos-metýl 20% + þíram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbia Governorate, Egyptaland) var notaður sem jákvæð viðmiðun. Svampaeitur sem er til sölu „Rizolex-T“ var prófað in vitro í fimm styrkleikum (2, 4, 6, 8 og 10 mg/L).
Sýni af baunastönglum og belgjum sem sýndu dæmigerð einkenni hvítmyglu (smithlutfall: 10–30%) voru tekin á atvinnubúum. Þó að flest smitaða plöntuefnin væru greind eftir tegund/afbrigði (næm atvinnuafbrigði Giza 3), voru önnur, sérstaklega þau sem fengust á staðbundnum mörkuðum, af óþekktri tegund. Sýkta efnið sem safnað var var fyrst sótthreinsað á yfirborði með 0,5% natríumhýpóklórítlausn í 3 mínútur, síðan skolað nokkrum sinnum með dauðhreinsuðu eimuðu vatni og þurrkuð með dauðhreinsuðum síupappír til að fjarlægja umfram vatn. Sýktu líffærin voru síðan skorin í litla bita úr miðjuvef (milli heilbrigðra og sýktra vefja), ræktuð á kartöfludextrósaagar (PDA) miðli og ræktuð við 25 ± 2°C með 12 klst. ljósi/12 klst. myrkri í 5 daga til að örva myndun hörðnunar. Sveppasnúðsaðferðin var einnig notuð til að hreinsa sveppaeinangrun úr blönduðum eða menguðum ræktunum. Hreinsaða sveppaeinangrunin var fyrst greind út frá ræktunarfræðilegum eiginleikum þess og síðan staðfest að vera S. sclerotiorum út frá smásjáreiginleikum. Að lokum voru öll hreinsuð einangruð stofn prófuð til að kanna sjúkdómsvaldandi eiginleika á viðkvæmu baunaafbrigðinu Giza 3 til að uppfylla Koch-forsendur.
Að auki var einangraðasta S. sclerotiorum einangraðasta bakterían (einangrun #3) staðfest frekar út frá innri umrituðum bilsgreiningu (ITS) eins og lýst er af White o.fl., 1990; Baturo-Ciesniewska o.fl., 2017. Í stuttu máli voru einangruð frumur ræktaðar í kartöfludextrósa seyði (PDB) og ræktaðar við 25 ± 2 °C í 5–7 daga. Sveppaþráðurinn var síðan safnaður, síaður í gegnum ostaklút, þveginn tvisvar með dauðhreinsuðu vatni og þurrkaður með dauðhreinsuðum síupappír. Erfðamengi DNA var einangrað með Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah o.fl., 2022, 2024). ITS rDNA svæðið var síðan magnað með því að nota sértæka praimerparið ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; væntanleg stærð: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska o.fl., 2017). Hreinsuðu PCR afurðirnar voru sendar til raðgreiningar (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). ITS rDNA raðirnar voru raðgreindar í tvíátta átt með Sanger raðgreiningaraðferðinni. Samsettar fyrirspurnarraðir voru síðan bornar saman við nýjustu gögn í GenBank og National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) með því að nota BLASTn hugbúnað. Fyrirspurnarraðin var borin saman við 20 önnur S. sclerotiorum stofna/einangrun sem sótt voru úr nýjustu gögnum í NCBI GenBank (viðbótartöflu S1) með því að nota ClustalW í Molecular Evolutionary Genetics Analysis Package (MEGA-11; útgáfa 11) (Kumar o.fl., 2024). Þróunargreining var framkvæmd með því að nota hámarkslíkindaaðferðina og almenna tímasnúanlega núkleótíðskiptingarlíkanið (Nei og Kumar, 2000). Tréð með hæstu log-líkindunum er sýnt. Upphafstréð fyrir reikniritið er valið með því að velja tréð með hærri log-líkindum milli neighbor-joining (NJ) trésins (Kumar o.fl., 2024) og hámarks parsimony (MP) trésins. NJ tréð var smíðað með því að nota paraða fjarlægðarfylki reiknað með almenna tímasnúanlega líkaninu (Nei og Kumar, 2000).
Sýklalyfjaáhrif L-ornitíns og bakteríudrepandi efnisins „Rizolex-T“ voru ákvörðuð in vitro með agar-dreifingaraðferð. Aðferð: Takið viðeigandi magn af stofnlausn af L-ornitíni (500 mg/L) og blandið því vandlega saman við 10 ml af PDA næringarmiðli til að útbúa lausnir með lokastyrk 12,5, 25, 50, 75, 100 og 125 mg/L, talið í sömu röð. Fimm styrkleikar af sveppaeyðandi efninu „Rizolex-T“ (2, 4, 6, 8 og 10 mg/L) og sæfðu eimuðu vatni voru notaðir sem samanburðarlausn. Eftir að miðillinn hafði storknað var nýbúinn sveppaþráður úr Sclerotinia sclerotiorum ræktun, 4 mm í þvermál, fluttur í miðju Petri-skálarinnar og ræktaður við 25 ± 2°C þar til sveppþráðurinn huldi alla samanburðar-Petri-skálina, eftir það var sveppavöxturinn skráður. Reiknið út prósentuhömlun á geislamyndunarvexti S. sclerotiorum með því að nota jöfnu 1:
Tilraunin var endurtekin tvisvar, með sex líffræðilegum endurteknum tilraunum fyrir hvern samanburðar-/tilraunahóp og fimm pottum (tvær plöntur í potti) fyrir hverja líffræðilega endurtekningu. Hver líffræðileg endurtekning var greind tvisvar (tvær tæknilegar endurtekningar) til að tryggja nákvæmni, áreiðanleika og endurtekningarhæfni tilraunaniðurstaðnanna. Að auki var notuð probit-aðhvarfsgreining til að reikna út hálf-hámarks hömlunarþéttni (IC50) og IC99 (Prentice, 1976).
Til að meta möguleika L-ornitíns við gróðurhúsaaðstæður voru gerðar tvær tilraunir í röð í pottum. Í stuttu máli voru pottarnir fylltir með sótthreinsaðri leir-sandi jarðvegi (3:1) og sáð með nýlagaðri ræktun af S. sclerotiorum. Fyrst var ágengasta einangraða stofninn af S. sclerotiorum (einangrun #3) ræktaður með því að skera einn sklerótíum í tvennt, leggja hann með framhliðina niður á PDA og rækta við 25°C í stöðugu myrkri (24 klst.) í 4 daga til að örva sveppavöxt. Fjórir 5 mm þvermál agartappi voru síðan teknir af fremri brúninni og sáð með 100 g af sótthreinsuðum blöndu af hveiti og hrísgrjónaklíði (1:1, v/v) og allar flöskur voru ræktaðar við 25 ± 2°C undir 12 klst. ljósi/12 klst. myrkri í 5 daga til að örva myndun sklerótíums. Innihald allra flöskunnar var vandlega blandað saman til að tryggja einsleitni áður en jarðvegi var bætt við. Síðan voru 100 g af nýlenduklíðblöndunni bætt í hvern pott til að tryggja stöðugan styrk sýkla. Pottarnir sem voru bólgnir voru vökvaðir til að virkja sveppavöxt og settir í gróðurhús í 7 daga.
Fimm fræ af Giza 3 afbrigðinu voru síðan sáð í hvern pott. Í pottunum sem meðhöndlaðir voru með L-ornitíni og sveppalyfinu Rizolex-T voru sótthreinsuðu fræin fyrst lögð í bleyti í tvær klukkustundir í vatnslausn af efnasamböndunum tveimur með loka IC99 styrk upp á um 250 mg/L og 50 mg/L, talið í sömu röð, og síðan loftþurrkað í eina klukkustund fyrir sáningu. Hins vegar voru fræin lögð í bleyti í sótthreinsuðu eimuðu vatni sem neikvæð viðmiðun. Eftir 10 daga, fyrir fyrstu vökvun, voru plönturnar þynntar út og aðeins tvær snyrtilegar plöntur voru eftir í hverjum potti. Til að tryggja sýkingu með S. sclerotiorum voru baunaplöntur á sama þroskastigi (10 dagar) skornar á tveimur mismunandi stöðum með sótthreinsuðum skurðhníf og um það bil 0,5 g af nýlenduklíðblöndunni var sett í hvert sár, fylgt eftir með miklum raka til að örva sýkingu og sjúkdómsþróun í öllum sáðplöntunum. Samanburðarplöntur voru særðar á sama hátt og jafnmikið magn (0,5 g) af dauðhreinsuðu, óþyrptu klíðblöndu var sett í sárið og haldið við mikinn raka til að líkja eftir umhverfi fyrir sjúkdómsþróun og tryggja samræmi milli meðferðarhópanna.
Meðferðaraðferð: Baunaplöntur voru vökvaðar með 500 ml af vatnslausn af L-ornitíni (250 mg/l) eða sveppalyfinu Rizolex-T (50 mg/l) með því að vökva jarðveginn, síðan var meðferðin endurtekin þrisvar sinnum með 10 daga millibili. Lyfleysuhóparnir voru vökvaðir með 500 ml af dauðhreinsuðu eimuðu vatni. Allar meðferðir voru framkvæmdar í gróðurhúsi (25 ± 2°C, 75 ± 1% rakastig og ljóstímabil 8 klst. ljós/16 klst. myrkur). Öllum pottum var vökvað á tveggja vikna fresti og þeir meðhöndlaðir mánaðarlega með jafnvægi NPK áburði (20-20-20, með 3,6% brennisteini og TE örefnum; Zain Seeds, Egyptaland) í styrk 3–4 g/l með blaðúða samkvæmt ráðleggingum fyrir viðkomandi afbrigði og leiðbeiningum framleiðanda. Nema annað sé tekið fram voru fullþroskuð laufblöð (annað og þriðja laufblaðið að ofan) safnað úr hverju líffræðilegu eftirmynd 72 klst. eftir meðhöndlun (hpt), einsleit, sameinuð og geymd við -80°C til frekari greininga, þar á meðal en ekki takmarkað við, staðsetningu oxunarálagsvísa á staðnum, fituperoxíðun, ensím- og ensímlaus andoxunarefni og genatjáningu.
Styrkur hvítmyglu var metinn vikulega 21 degi eftir ígræðslu (dpi) með kvarða frá 1–9 (viðbótartafla S2) byggður á kvarða Petzoldt og Dickson (1996) sem Teran o.fl. (2006) breyttu. Í stuttu máli voru stilkar og greinar baunaplantna skoðaðar frá ígræðslustað til að fylgja framvindu meinsemda meðfram millihnútum og hnútum. Fjarlægð meinsemdarinnar frá ígræðslustað að lengsta punkti meðfram stilknum eða greininni var síðan mæld og stig frá 1–9 voru gefin út frá staðsetningu meinsemdarinnar, þar sem (1) gaf til kynna enga sýnilega sýkingu nálægt ígræðslustað og (2–9) gaf til kynna stigvaxandi aukningu á stærð meinsemdarinnar og framvindu meðfram hnútum/millihnútum (viðbótartafla S2). Styrkur hvítmyglu var síðan umreiknaður í prósentu með formúlu 2:
Að auki var flatarmálið undir sjúkdómsþróunarferlinum (AUDPC) reiknað með formúlunni (Shaner og Finney, 1977), sem nýlega var aðlöguð fyrir hvítfúgun á baunum (Chauhan o.fl., 2020) með jöfnu 3:
Þar sem Yi = alvarleiki sjúkdómsins á tíma ti, Yi+1 = alvarleiki sjúkdómsins við næstu mælingu ti+1, ti = tími fyrstu mælingar (í dögum), ti+1 = tími næstu mælingar (í dögum), n = heildarfjöldi tímapunkta eða athugunarpunkta. Vaxtarbreytur baunaplantna, þar á meðal hæð plantna (cm), fjöldi greina á plöntu og fjöldi laufa á plöntu, voru skráðir vikulega í 21 dag í öllum líffræðilegum endurteknum prófunum.
Í hverri líffræðilegri eftirlíkingu voru blaðsýni (annað og þriðja fullþróuð blað efst) tekin á 45. degi eftir meðferð (15 dögum eftir síðustu meðferð). Hver líffræðileg eftirlíking samanstóð af fimm pottum (tvær plöntur í hverjum potti). Um 500 mg af muldum vef voru notuð til að vinna út ljóstillífandi litarefni (blaðgrænu a, blaðgrænu b og karótínóíð) með 80% asetóni við 4°C í myrkri. Eftir 24 klst. voru sýnin skiljuð og ofanfljótandi vökvinn safnað til að ákvarða innihald blaðgrænu a, blaðgrænu b og karótínóíða með litrófsmælingu með UV-160A litrófsmæli (Shimadzu Corporation, Japan) samkvæmt aðferð (Lichtenthaler, 1987) með því að mæla gleypni við þrjár mismunandi bylgjulengdir (A470, A646 og A663 nm). Að lokum var innihald ljóstillífandi litarefna reiknað með eftirfarandi formúlum 4–6 sem lýst er af Lichtenthaler (1987).
72 klst. eftir meðferð (hpt) voru laufblöð (annað og þriðja fullþróuð laufblöð að ofan) tekin úr hverju líffræðilegu eftirlíkingarprófi til að greina vetnisperoxíð (H2O2) og súperoxíðanjón (O2•−) á staðnum. Hvert líffræðilegt eftirlíkingarpróf samanstóð af fimm pottum (tvær plöntur í hverju potti). Hvert líffræðilegt eftirlíkingarpróf var greint í tvíriti (tvær tæknilegar eftirlíkingar) til að tryggja nákvæmni, áreiðanleika og endurtekningarhæfni aðferðarinnar. H2O2 og O2•− voru ákvörðuð með því að nota 0,1% 3,3′-díamínóbensidín (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Þýskalandi) eða nítróbláa tetrasólíum (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Þýskalandi), talið í sömu röð, samkvæmt aðferðum sem lýst er af Romero-Puertas o.fl. (2004) og Adam o.fl. (1989) með minniháttar breytingum. Til að staðsetja H2O2 á staðnum voru smáblöðin lofttæmd með 0,1% DAB í 10 mM Tris stuðpúða (pH 7,8) og síðan ræktuð við stofuhita í ljósi í 60 mínútur. Smáblöðin voru bleikt í 0,15% (v/v) TCA í 4:1 (v/v) etanóli:klóróformi (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kaíró, Egyptalandi) og síðan látin í ljós þar til þau dökknuðu. Á sama hátt voru lokurnar lofttæmdar með 10 mM kalíumfosfat stuðpúða (pH 7,8) sem innihélt 0,1 w/v% HBT til að staðsetja O2•− á staðnum. Smáblöðin voru ræktuð í ljósi við stofuhita í 20 mínútur, síðan bleikt eins og að ofan og síðan lýst upp þar til dökkbláir/fjólubláir blettir birtust. Styrkur brúna litarins (sem H2O2 vísir) eða bláfjólubláa litarins (sem O2•− vísir) sem myndaðist var metinn með Fiji útgáfunni af myndvinnsluforritinu ImageJ (http://fiji.sc; skoðað 7. mars 2024).
Malondialdehýð (MDA; sem merki um fituperoxíðun) var ákvarðað samkvæmt aðferð Du og Bramlage (1992) með smávægilegum breytingum. Blöð úr hverri líffræðilegri eftirlíkingu (önnur og þriðja fullþróuð lauf að ofan) voru tekin 72 klst. eftir meðhöndlun (hpt). Hver líffræðileg eftirlíking innihélt fimm potta (tvær plöntur í hverjum potti). Hver líffræðileg eftirlíking var greind í tvíriti (tvær tæknilegar eftirlíkingar) til að tryggja nákvæmni, áreiðanleika og endurtekningarhæfni aðferðarinnar. Í stuttu máli voru 0,5 g af möluðum laufvef notaðir til MDA útdráttar með 20% tríklóredíksýru (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, Bandaríkjunum) sem innihélt 0,01% bútýlerað hýdroxýtólúen (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Bandaríkjunum). MDA-innihaldið í ofanvökvanum var síðan ákvarðað litrófsmælandi með því að mæla gleypni við 532 og 600 nm með UV-160A litrófsmæli (Shimadzu Corporation, Japan) og síðan tjáð sem nmól g−1 FW.
Til að meta andoxunarefni án og án ensíma voru laufblöð (annað og þriðja fullþróuð laufblöð að ofan) tekin úr hverju líffræðilegu eftirlíkingarsýni 72 klst. eftir meðferð. Hvert líffræðilegt eftirlíkingarsýni samanstóð af fimm pottum (tvær plöntur í hverjum potti). Hvert líffræðilegt sýni var greint í tvíriti (tvö tæknileg sýni). Tvö laufblöð voru möluð með fljótandi köfnunarefni og notuð beint til að ákvarða ensímvirk og án andoxunarefna, heildar amínósýrur, prólíninnihald, genatjáningu og magngreiningu oxalat.
Heildarleysanlegt fenólmagn var ákvarðað með Folin-Ciocalteu hvarfefni (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Bandaríkjunum) með smávægilegum breytingum á aðferðinni sem lýst er af Kahkonen o.fl. (1999). Í stuttu máli var um það bil 0,1 g af einsleitu laufvef dregið út með 20 ml af 80% metanóli í myrkri í 24 klst. og ofanfljótandi vökvinn var safnað eftir skilvindu. 0,1 ml af sýnisútdrættinum var blandað saman við 0,5 ml af Folin-Ciocalteu hvarfefni (10%), hrist í 30 sekúndur og látið standa í myrkri í 5 mínútur. Síðan voru 0,5 ml af 20% natríumkarbónatlausn (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Kaíró, Egyptaland) bætt í hvert rör, blandað vel saman og ræktað við stofuhita í myrkri í 1 klst. Eftir ræktun var gleypni hvarfblöndunnar mæld við 765 nm með UV-160A litrófsmæli (Shimadzu Corporation, Japan). Styrkur heildarleysanlegra fenóla í sýnisútdrættunum var ákvarðaður með kvörðunarkúrfu fyrir gallínsýru (Fisher Scientific, Hampton, NH, Bandaríkin) og gefinn upp sem milligrömm af gallínsýrujafngildi á hvert gramm af ferskþyngd (mg GAE g-1 ferskþyngd).
Heildarmagn leysanlegra flavonoíða var ákvarðað samkvæmt aðferð Djeridane o.fl. (2006) með smávægilegum breytingum. Í stuttu máli voru 0,3 ml af ofangreindu metanólútdrætti blandað saman við 0,3 ml af 5% álklóríðlausn (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, Bandaríkin), hrært kröftuglega og síðan ræktað við stofuhita í 5 mínútur, og síðan bætt við 0,3 ml af 10% kalíumasetatlausn (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kaíró, Egyptaland), blandað vandlega saman og ræktað við stofuhita í 30 mínútur í myrkri. Eftir ræktun var gleypni hvarfblöndunnar mæld við 430 nm með UV-160A litrófsmæli (Shimadzu Corporation, Japan). Styrkur heildar leysanlegra flavonoíða í sýnisútdrætti var ákvarðaður með rutín kvörðunarferli (TCI America, Portland, OR, Bandaríkin) og síðan tjáður sem milligrömm af rutínjafngildi á hvert gramm af ferskþyngd (mg RE g-1 ferskþyngd).
Heildarmagn frírra amínósýra í baunablöðum var ákvarðað með breyttu nínhýdrín hvarfefni (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, Bandaríkjunum) byggt á aðferð sem Yokoyama og Hiramatsu (2003) lögðu til og Sun o.fl. (2006) breyttu. Í stuttu máli var 0,1 g af möluðum vefjum dregið út með pH 5,4 stuðpúða og 200 μL af ofanvökvanum voru látin hvarfast við 200 μL af nínhýdríni (2%) og 200 μL af pýridíni (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, Bandaríkin), ræktað í sjóðandi vatnsbaði í 30 mínútur, síðan kælt og mælt við 580 nm með UV-160A litrófsmæli (Shimadzu Corporation, Japan). Hins vegar var prólín ákvarðað með Bates aðferðinni (Bates o.fl., 1973). Prólín var dregið út með 3% súlfósalisýlsýru (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, Bandaríkjunum) og eftir skilvindu voru 0,5 ml af ofanvökvanum blandað saman við 1 ml af ísediki (Fisher Scientific, Hampton, NH, Bandaríkin) og nínhýdrín hvarfefni, ræktað við 90°C í 45 mínútur, kælt og mælt við 520 nm með sama litrófsmæli og að ofan. Heildarfrjálsar amínósýrur og prólín í laufútdrættunum voru ákvörðuð með glýsín- og prólínkvörðunarkúrfum (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Bandaríkjunum), talið í sömu röð, og gefin upp sem mg/g af ferskum þyngd.
Til að ákvarða ensímvirkni andoxunarensíma voru um það bil 500 mg af einsleitum vefjum teknir út með 3 ml af 50 mM Tris stuðpúða (pH 7,8) sem innihélt 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Bandaríkin) og 7,5% pólývínýlpyrrólídon (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Bandaríkin), skilvindaðir við 10.000 × g í 20 mínútur í kæli (4°C) og ofanfljótandi vökvinn (hrár ensímútdráttur) safnað (El-Nagar o.fl., 2023; Osman o.fl., 2023). Katalasi (CAT) var síðan látið hvarfast við 2 ml af 0,1 M natríumfosfatlausn (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Bandaríkin) og 100 μl af 269 mM H2O2 lausn til að ákvarða ensímvirkni þess samkvæmt aðferð Aebi (1984) með smávægilegum breytingum (El-Nagar o.fl., 2023; Osman o.fl., 2023). Ensímvirkni gúaíakólháðs peroxídasa (POX) var ákvörðuð með aðferð Harrach o.fl. (2009). (2008) með minniháttar breytingum (El-Nagar o.fl., 2023; Osman o.fl., 2023) og ensímvirkni pólýfenóloxídasa (PPO) var ákvörðuð eftir viðbrögð við 2,2 ml af 100 mM natríumfosfatlausn (pH 6,0), 100 μl af gúaíakóli (TCI chemicals, Portland, OR, Bandaríkjunum) og 100 μl af 12 mM H2O2. Aðferðin var lítillega breytt frá (El-Nagar o.fl., 2023; Osman o.fl., 2023). Prófunin var framkvæmd eftir viðbrögð við 3 ml af katekóllausn (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, Bandaríkjunum) (0,01 M) nýlagaðri í 0,1 M fosfatlausn (pH 6,0). CAT-virkni var mæld með því að fylgjast með niðurbroti H2O2 við 240 nm (A240), POX-virkni var mæld með því að fylgjast með aukningu í gleypni við 436 nm (A436) og PPO-virkni var mæld með því að skrá sveiflur í gleypni við 495 nm (A495) á 30 sekúndna fresti í 3 mínútur með UV-160A litrófsmæli (Shimadzu, Japan).
Rauntíma RT-PCR var notað til að greina umritunarmagn þriggja gena sem tengjast andoxunarefnum, þar á meðal peroxisomal katalasa (PvCAT1; GenBank aðgangsnúmer KF033307.1), superoxíð dismutasa (PvSOD; GenBank aðgangsnúmer XM_068639556.1) og glútaþíon redúktasa (PvGR; GenBank aðgangsnúmer KY195009.1), í baunablöðum (annað og þriðja fullþróaða laufin að ofan) 72 klst. eftir síðustu meðferð. Í stuttu máli var RNA einangrað með Simply P Total RNA Extraction Kit (Cat. No. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Kína) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Síðan var cDNA myndað með TOP script™ cDNA Synthesis Kit samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Praimeraraðir ofangreindra þriggja gena eru taldar upp í viðbótartöflu S3. PvActin-3 (GenBank aðgangsnúmer: XM_068616709.1) var notað sem housekeeping gen og hlutfallsleg genatjáning var reiknuð með 2-ΔΔCT aðferðinni (Livak og Schmittgen, 2001). Sýnt var fram á stöðugleika aktíns við lífrænt álag (ósamrýmanleg víxlverkun milli algengra belgjurta og antrasveppsins Colletotrichum lindemuthianum) og ólífrænt álag (þurrkar, selta, lágt hitastig) (Borges o.fl., 2012).
Við framkvæmdum fyrst erfðamengisgreiningu in silico á oxaloacetate asetýlhýdrólasa (OAH) próteinum í S. sclerotiorum með því að nota prótein-prótein BLAST tólið (BLASTp 2.15.0+) (Altschul o.fl., 1997, 2005). Í stuttu máli notuðum við OAH úr Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxíð: 1191702; GenBank aðgangsnúmer XP_040799428.1; 342 amínósýrur) og Penicillium lagena (PlOAH; taxíð: 94218; GenBank aðgangsnúmer XP_056833920.1; 316 amínósýrur) sem fyrirspurnarraðir til að kortleggja samsvarandi prótein í S. sclerotiorum (taxíð: 5180). BLASTp var framkvæmt gegn nýjustu tiltæku erfðamengisgögnum S. sclerotiorum í GenBank á vefsíðu National Center for Biotechnology Information (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Að auki var ályktað um spáð OAH gen úr S. sclerotiorum (SsOAH) og þróunargreining og ættartré AfOAH úr A. fijiensis CBS 313.89 og PlOAH úr P. lagena með því að nota hámarkslíkindaaðferðina í MEGA11 (Tamura o.fl., 2021) og JTT fylkislíkanið (Jones o.fl., 1992). Ættartréð var sameinað margfaldri röðunargreiningu á próteinröðum allra spáðra OAH gena (SsOAH) úr S. sclerotiorum og fyrirspurnarröðinni með því að nota Constraint-Based Alignment Tool (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos og Agarwala, 2007). Að auki voru bestu pörunar amínósýruröð SsOAH úr S. sclerotiorum samstilltar við fyrirspurnarröðina (AfOAH og PlOAH) (Larkin o.fl., 2007) með því að nota ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), og varðveitt svæði í röðuninni voru sýnd með ESPript tólinu (útgáfa 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Ennfremur voru spáð virknislén og varðveitt svæði S. sclerotiorum SsOAH flokkuð gagnvirkt í mismunandi fjölskyldur með því að nota InterPro tólið (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum o.fl., 2021). Að lokum var þrívíddar (3D) byggingarlíkön af spáðu S. sclerotiorum SsOAH framkvæmd með því að nota Protein Homology/Analogy Recognition Engine (Phyre2 server version 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley o.fl., 2015) og staðfest með SWISS-MODEL servernum (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini o.fl., 2014). Spáðar þrívíddarbyggingar (PDB snið) voru gagnvirkt sýndar með því að nota UCSF-Chimera pakkann (útgáfa 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen o.fl., 2004).
Megindleg rauntíma flúrljómunar-PCR var notuð til að ákvarða umritunarstig oxaloacetat asetýlhýdrólasa (SsOAH; GenBank aðgangsnúmer: XM_001590428.1) í sveppþráðum Sclerotinia sclerotiorum. Í stuttu máli var S. sclerotiorum sáð í flösku sem innihélt PDB og sett í hristandi ræktunarofn (gerð: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, Bandaríkin) við 25 ± 2 °C í 24 klst. við 150 snúninga á mínútu og í stöðugu myrkri (24 klst.) til að örva sveppavöxt. Því næst voru frumurnar meðhöndlaðar með L-ornitíni og sveppalyfinu Rizolex-T við loka IC50 styrk (u.þ.b. 40 og 3,2 mg/L, talið í sömu röð) og síðan ræktaðar í aðra 24 klst. við sömu aðstæður. Eftir ræktun voru ræktanirnar skilvindaðar við 2500 snúninga á mínútu í 5 mínútur og ofanfljótandi efni (sveppaþráður) safnað til greiningar á genatjáningu. Á sama hátt var sveppaþráður safnað 0, 24, 48, 72, 96 og 120 klst. eftir sýkingu úr sýktum plöntum sem höfðu myndað hvítmyglu og bómullarþráð á yfirborði sýktra vefja. RNA var dregið út úr sveppaþráðnum og síðan var cDNA myndað eins og lýst er hér að ofan. Forraðir fyrir SsOAH eru taldar upp í viðbótartöflu S3. SsActin (GenBank aðgangsnúmer: XM_001589919.1) var notað sem viðhaldsgen og hlutfallsleg genatjáning var reiknuð með 2-ΔΔCT aðferðinni (Livak og Schmittgen, 2001).
Oxalsýra var ákvörðuð í kartöfludextrósaþykkni (PDB) og plöntusýnum sem innihéldu sveppasýkingarvaldinn Sclerotinia sclerotiorum samkvæmt aðferð Xu og Zhang (2000) með smávægilegum breytingum. Í stuttu máli voru einangruð S. sclerotiorum frumur sáð í flöskur sem innihéldu PDB og síðan ræktaðar í hristandi ræktunarofni (gerð I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, Bandaríkjunum) við 150 snúninga á mínútu við 25 ± 2 °C í 3–5 daga í stöðugu myrkri (24 klst.) til að örva sveppavöxt. Eftir ræktun var svepparæktunin fyrst síuð í gegnum Whatman #1 síupappír og síðan skiljuð við 2500 snúninga á mínútu í 5 mínútur til að fjarlægja leifar af sveppaþráðum. Yfirborðsvökvinn var safnað og geymdur við 4°C til frekari magnbundinnar ákvörðunar á oxalati. Til að undirbúa plöntusýnin voru um það bil 0,1 g af plöntuvefsbrotum dregin út þrisvar sinnum með eimuðu vatni (2 ml í hvert skipti). Sýnin voru síðan skiljuð með skilvindu við 2500 snúninga á mínútu í 5 mínútur, ofanfljótandi vökvinn var þurrsíaður í gegnum Whatman nr. 1 síupappír og safnað til frekari greiningar.
Til megindlegrar greiningar á oxalsýru var hvarfblandan útbúin í glertappa í eftirfarandi röð: 0,2 ml af sýni (eða PDB ræktunarsíuvökvi eða staðallausn oxalsýru), 0,11 ml af brómófenólbláu (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, Bandaríkjunum), 0,198 ml af 1 M brennisteinssýru (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kaíró, Egyptalandi) og 0,176 ml af 100 mM kalíumdíkrómati (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, Bandaríkjunum), og síðan var lausnin þynnt í 4,8 ml með eimuðu vatni, hrærð kröftuglega og sett strax í 60°C vatnsbað. Eftir 10 mínútur var hvarfið stöðvað með því að bæta við 0,5 ml af natríumhýdroxíðlausn (NaOH; 0,75 M). Gleypni (A600) hvarfblöndunnar var mæld við 600 nm með UV-160 litrófsmæli (Shimadzu Corporation, Japan). PDB og eimað vatn voru notuð sem samanburðarhópur fyrir magngreiningu ræktunarvökva og plöntusýna, talið í sömu röð. Styrkur oxalsýru í ræktunarvökvunum, gefinn upp sem míkrógrömm af oxalsýru á millilítra af PDB miðli (μg.mL⁻¹), og í laufútdrættinum, gefinn upp sem míkrógrömm af oxalsýru á hvert gramm af ferskþyngd (μg.g⁻¹ FW), var ákvarðaður með kvörðunarferli oxalsýru (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, Bandaríkjunum).
Í rannsókninni voru allar tilraunir hannaðar með fullkomlega slembiraðaðri hönnun (CRD) með sex líffræðilegum endurteknum tilraunum á meðferð og fimm pottum á líffræðilega endurtekningu (tvær plöntur í potti) nema annað sé tekið fram. Líffræðilegar endurtekningar voru greindar í tvíriti (tvær tæknilegar endurtekningar). Tæknilegar endurtekningar voru notaðar til að athuga endurtekningarhæfni sömu tilraunar en voru ekki notaðar í tölfræðilegri greiningu til að forðast falskar endurtekningar. Gögnin voru tölfræðilega greind með dreifigreiningu (ANOVA) og síðan Tukey-Kramer heiðarlega marktækum mismunarprófi (HSD) (p ≤ 0,05). Fyrir in vitro tilraunir voru IC50 og IC99 gildi reiknuð með probit líkaninu og 95% öryggisbil reiknuð.
Alls voru fjögur einangruð frumefni safnað frá mismunandi sojabaunaökrum í El Ghabiya héraði í Egyptalandi. Á PDA ræktunarmiðli framleiddu öll einangruð frumefni rjómalöguð hvít sveppaþráð sem varð fljótt bómullarhvít (Mynd 1A) og síðan beige eða brún á hörpuskeljastigi. Hörpuskeljar eru venjulega þéttar, svartar, kúlulaga eða óreglulegar í lögun, 5,2 til 7,7 mm langar og 3,4 til 5,3 mm í þvermál (Mynd 1B). Þó að fjögur einangruð frumefni hafi þróað jaðarmynstur af hörpuskeljum á jaðri ræktunarmiðilsins eftir 10–12 daga ræktun við 25 ± 2 °C (Mynd 1A), var fjöldi hörpuskelja á plötu marktækt mismunandi á milli þeirra (P < 0,001), þar sem einangrun 3 hafði hæsta fjölda hörpuskelja (32,33 ± 1,53 hörpuskeljar á plötu; Mynd 1C). Á sama hátt framleiddi einangrun #3 meiri oxalsýru í PDB en önnur einangruð efni (3,33 ± 0,49 μg.mL⁻¹; Mynd 1D). Einangrun #3 sýndi dæmigerða formfræðilega og smásjárfræðilega eiginleika plöntusjúkdómsvaldandi sveppsins Sclerotinia sclerotiorum. Til dæmis, á PDA, uxu ​​nýlendur einangruðs #3 hratt, voru rjómahvítar (Mynd 1A), öfugbeislitar eða ljós laxagulbrúnar og þurftu 6-7 daga við 25 ± 2°C til að þekja yfirborð 9 cm þvermálsplötu alveg. Byggt á ofangreindum formfræðilegum og smásjárfræðilegum einkennum var einangrun #3 auðkennd sem Sclerotinia sclerotiorum.
Mynd 1. Einkenni og sjúkdómsvaldandi áhrif S. sclerotiorum stofna úr algengum belgjurtum. (A) Sveppasveppvöxtur fjögurra S. sclerotiorum stofna á PDA ræktunarmiðli, (B) hörðnun fjögurra S. sclerotiorum stofna, (C) fjöldi hörðnunar (á plötu), (D) oxalsýruseyting á PDB ræktunarmiðli (μg.mL−1) og (E) alvarleiki sjúkdómsins (%) fjögurra S. sclerotiorum stofna á viðkvæmum belgjurtaræktunarafbrigðum af tegundinni Giza 3 við gróðurhúsaástand. Gildi tákna meðaltal ± staðalfrávik fimm líffræðilegra endurtekinna prófana (n = 5). Mismunandi stafir gefa til kynna tölfræðilega marktækan mun á milli meðferða (p < 0,05). (F–H) Dæmigerð einkenni hvítmyglu komu fram á ofanjarðar stilkum og kísilþráðum, talið í sömu röð, 10 dögum eftir ígræðslu með stofni #3 (dpi). (I) Þróunargreining á innri umrituðu bilssvæði (ITS) í S. sclerotiorum einangrun #3 var framkvæmd með aðferðinni „maximum likelihood“ og borin saman við 20 viðmiðunarstofna/stofna sem fengust úr gagnagrunni National Center for Biotechnology Information (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Tölurnar fyrir ofan klasalínurnar gefa til kynna svæðisþekju (%) og tölurnar fyrir neðan klasalínurnar gefa til kynna greinarlengd.
Ennfremur, til að staðfesta sjúkdómsvaldandi eiginleika, voru fjögur einangruð S. sclerotiorum notuð til að bólusetja næma baunaafbrigðið Giza 3 í gróðurhúsalofttegundum, sem er í samræmi við forsendur Kochs (Mynd 1E). Þó að öll einangruð sveppasýkingarnar væru sjúkdómsvaldandi og gætu smitað grænu baunina (afbrigði Giza 3), sem olli dæmigerðum hvítmyglueinkennum á öllum ofanjarðarhlutum (Mynd 1F), sérstaklega á stilkunum (Mynd 1G) og belgjum (Mynd 1H) 10 dögum eftir bólusetningu (dpi), var einangrun 3 árásargjarnasta einangrunin í tveimur óháðum tilraunum. Einangrun 3 hafði hæsta alvarleika sjúkdómsins (%) á baunaplöntum (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 og 76,7 ± 3,1 7, 14 og 21 degi eftir sýkingu, talið í sömu röð; Mynd 1F).
Greining á ágengasta S. sclerotiorum einangraði #3 var frekar staðfest út frá innri umrituðum bilsgreiningu (ITS) (Mynd 1I). Þyrpingafræðileg greining á einangruðu #3 og 20 viðmiðunarstofnum/stofnum sýndi mikla líkindi (>99%) á milli þeirra. Það er vert að taka fram að S. sclerotiorum einangrun #3 (533 bp) hefur mikla líkindi við bandaríska S. sclerotiorum einangraði LPM36 sem einangrað var úr þurrkuðum baunafræjum (GenBank aðgangsnúmer MK896659.1; 540 bp) og kínverska S. sclerotiorum einangraði YKY211 (GenBank aðgangsnúmer OR206374.1; 548 bp), sem veldur fjólubláum stilkrötun (Matthiola incana), sem öll eru flokkuð sérstaklega efst á myndritinu (Mynd 1I). Nýja raðgreiningin hefur verið sett í gagnagrunn NCBI og nefnd „Sclerotinia sclerotiorum – einangrun YN-25“ (GenBank aðgangsnúmer PV202792). Það má sjá að einangrun 3 er ífarandi einangrunin; því var þessi einangrun valin til rannsókna í öllum síðari tilraunum.
Sóttthreinsandi virkni díamínsins L-ornitíns (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Þýskalandi) við mismunandi styrk (12,5, 25, 50, 75, 100 og 125 mg/L) gegn S. sclerotiorum einangrun 3 var rannsökuð in vitro. Það er athyglisvert að L-ornitín hafði bakteríudrepandi áhrif og hamlaði smám saman geislavöxt S. sclerotiorum sveppaþráða á skammtaháðan hátt (Mynd 2A, B). Við hæsta styrk sem prófaður var (125 mg/L) sýndi L-ornitín hæstu hömlunartíðni á sveppavöxt (99,62 ± 0,27%; Mynd 2B), sem jafngilti sveppalyfinu Rizolex-T sem er í boði í verslun (hömlunartíðni 99,45 ± 0,39%; Mynd 2C) við hæsta styrk sem prófaður var (10 mg/L), sem bendir til svipaðrar virkni.
Mynd 2. Sýklalyfjavirkni L-ornitíns gegn Sclerotinia sclerotiorum in vitro. (A) Samanburður á sýklalyfjavirkni mismunandi styrkleika af L-ornitíni gegn S. sclerotiorum við sveppalyfið Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Hömlunarhlutfall (%) á vexti sveppa í S. sclerotiorum eftir meðferð með mismunandi styrkleika af L-ornitíni (12,5, 25, 50, 75, 100 og 125 mg/L) eða Rizolex-T (2, 4, 6, 8 og 10 mg/L), talið í sömu röð. Gildi tákna meðaltal ± staðalfrávik fimm líffræðilegra endurtekinna prófana (n = 5). Mismunandi stafir tákna tölfræðilegan mun á milli meðferða (p < 0,05). (D, E) Probit líkan aðhvarfsgreining á L-ornitíni og sveppalyfinu Rizolex-T, talið í sömu röð. Aðhvarfslínan í probit-líkaninu er sýnd sem samfelld blá lína og öryggisbilið (95%) er sýnt sem strikað rauð lína.
Að auki var framkvæmd probit-aðhvarfsgreining og samsvarandi línurit eru sýnd í töflu 1 og myndum 2D og E. Í stuttu máli benti viðunandi hallatölugildi (y = 2,92x − 4,67) og tengd marktæk tölfræði (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 og p < 0,0001; mynd 2D) fyrir L-ornitín til aukinnar sveppaeyðandi virkni gegn S. sclerotiorum samanborið við sveppaeyðið Rizolex-T sem er í boði í verslunum (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 og p < 0,0001) (Tafla 1).
Tafla 1. Gildi fyrir hálfan hámarks hamlandi styrk (IC50) og IC99 (mg/l) af L-ornitíni og sveppalyfinu „Rizolex-T“ gegn S. sclerotiorum.
Í heildina dró L-ornitín (250 mg/L) marktækt úr þróun og alvarleika hvítmyglu á meðhöndluðum baunaplöntum samanborið við ómeðhöndlaðar plöntur sem voru sýktar af S. sclerotiorum (viðmiðunarhópur; mynd 3A). Í stuttu máli, þó að alvarleiki sjúkdómsins í ómeðhöndluðum sýktum samanburðarplöntum jókst smám saman (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61 og 92,33 ± 3,06%), dró L-ornitín marktækt úr alvarleika sjúkdómsins (%) allan tilraunartímann (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00 og 26,36 ± 3,07) 7, 14 og 21 degi eftir meðferð (dpt), talið í sömu röð (mynd 3A). Á sama hátt, þegar baunaplöntur sýktar af S. sclerotiorum voru meðhöndlaðar með 250 mg/L af L-ornitíni, minnkaði flatarmálið undir sjúkdómsframvinduferlinum (AUDPC) úr 1274,33 ± 33,13 í ómeðhöndluðu samanburðarhópnum í 281,03 ± 7,95, sem var örlítið lægra en í jákvæða samanburðarhópnum með 50 mg/L af Rizolex-T sveppalyfinu (183,61 ± 7,71; Mynd 3B). Sama þróun sást í annarri tilrauninni.
Mynd 3. Áhrif utanaðkomandi gjöf L-ornitíns á þróun hvítfúðu í baunum af völdum Sclerotinia sclerotiorum við gróðurhúsaaðstæður. (A) Sjúkdómsþróunarferill hvítmyglu í baunum eftir meðferð með 250 mg/L af L-ornitíni. (B) Flatarmál undir sjúkdómsþróunarferlinum (AUDPC) í hvítmyglu í baunum eftir meðferð með L-ornitíni. Gildi tákna meðaltal ± staðalfrávik fimm líffræðilegra endurtekninga (n = 5). Mismunandi stafir tákna tölfræðilega marktækan mun milli meðferða (p < 0,05).
Utanaðkomandi gjöf á 250 mg/L af L-ornitíni jók smám saman hæð plantna (mynd 4A), fjölda greina á plöntu (mynd 4B) og fjölda laufa á plöntu (mynd 4C) eftir 42 daga. Þó að sveppaeyðirinn Rizolex-T (50 mg/L) hefði mest áhrif á alla næringarþætti sem rannsakaðir voru, hafði utanaðkomandi gjöf á 250 mg/L af L-ornitíni næstmest áhrif samanborið við ómeðhöndlaða samanburðarhópa (myndir 4A–C). Hins vegar hafði meðferð með L-ornitíni engin marktæk áhrif á innihald ljóstillífandi litarefnanna blaðgrænu a (mynd 4D) og blaðgrænu b (mynd 4E), en jók heildarinnihald karótínóíða lítillega (0,56 ± 0,03 mg/g frá þyngd) samanborið við neikvæða samanburðarhópinn (0,44 ± 0,02 mg/g frá þyngd) og jákvæða samanburðarhópinn (0,46 ± 0,02 mg/g frá þyngd; mynd 4F). Í heildina benda þessar niðurstöður til þess að L-ornitín sé ekki plöntueitur fyrir meðhöndlaðar belgjurtir og geti jafnvel örvað vöxt þeirra.
Mynd 4. Áhrif utanaðkomandi L-ornitíngjafar á vaxtareiginleika og ljóstillífandi litarefni baunalaufa sem sýkt eru af Sclerotinia sclerotiorum í gróðurhúsalofttegundum. (A) Hæð plantna (cm), (B) Fjöldi greina á plöntu, (C) Fjöldi laufblaða á plöntu, (D) Klórófyll a innihald (mg g-1 frá þyngd), (E) Klórófyll b innihald (mg g-1 frá þyngd), (F) Heildar karótínóíð innihald (mg g-1 frá þyngd). Gildi eru meðaltal ± staðalfrávik fimm líffræðilegra endurtekninga (n = 5). Mismunandi stafir gefa til kynna tölfræðilega marktækan mun milli meðferða (p < 0,05).
Staðsetning hvarfgjarnra súrefnistegunda (ROS; tjáð sem vetnisperoxíð [H2O2]) og sindurefna (tjáð sem súperoxíðanjónir [O2•−]) in situ leiddi í ljós að utanaðkomandi gjöf L-ornitíns (250 mg/L) minnkaði verulega uppsöfnun H2O2 (96,05 ± 5,33 nmól.g−1 FW; Mynd 5A) og O2•− (32,69 ± 8,56 nmól.g−1 FW; Mynd 5B) samanborið við uppsöfnun bæði í ómeðhöndluðum sýktum plöntum (173,31 ± 12,06 og 149,35 ± 7,94 nmól.g−1 FW, talið í sömu röð) og plöntum sem meðhöndlaðar voru með 50 mg/L af sveppalyfinu Rizolex-T (170,12 ± 9,50 og 157,00 ± 7,81 nmól.g−1 fr wt, talið í sömu röð) eftir 72 klst. Hátt magn H2O2 og O2•− safnaðist upp undir húðun (hpt) (Mynd 5A, B). Á sama hátt sýndi TCA-byggð malondialdehýð (MDA) próf að baunaplöntur sem voru sýktar af S. sclerotiorum söfnuðu hærra magni af MDA (113,48 ± 10,02 nmól.g frá wt) í laufblöðum sínum (Mynd 5C). Hins vegar dró utanaðkomandi notkun L-ornitíns verulega úr lípíðperoxíðun eins og sést af lækkun á MDA-innihaldi í meðhöndluðum plöntum (33,08 ± 4,00 nmól.g frá wt).
Mynd 5. Áhrif utanaðkomandi L-ornitíngjafar á helstu merki oxunarálags og andoxunarvarnarkerfi sem ekki tengjast ensímum í baunablöðum sem sýkt eru af S. sclerotiorum 72 klst. eftir sýkingu við gróðurhúsaástand. (A) Vetnisperoxíð (H2O2; nmól g−1 FW) við 72 hpt, (B) súperoxíðanjón (O2•−; nmól g−1 FW) við 72 hpt, (C) malondialdehýð (MDA; nmól g−1 FW) við 72 hpt, (D) heildar leysanleg fenól (mg GAE g−1 FW) við 72 hpt, (E) heildar leysanleg flavonoid (mg RE g−1 FW) við 72 hpt, (F) heildarfríar amínósýrur (mg g−1 FW) við 72 hpt og (G) prólíninnihald (mg g−1 FW) við 72 hpt. Gildi tákna meðaltal ± staðalfrávik (meðaltal ± staðalfrávik) fyrir 5 líffræðilegar endurtekningar (n = 5). Mismunandi stafir gefa til kynna tölfræðilega marktækan mun milli meðferða (p < 0,05).