Mismunandi kenningar um varnarkerfi plantna veita mikilvæga fræðilega leiðsögn til að útskýra mynstur sérhæfðra efnaskipta plantna, en lykilspár þeirra eru enn óprófaðar. Hér notuðum við óhlutdræga tandem massagreiningu (MS/MS) til að kanna kerfisbundið efnaskipti veiklaðra tóbaksstofna frá einstökum plöntum til stofna og náskyldra tegunda, og unnum úr fjölda massagreiningarkenninga byggðar á efnasamböndarrófum í upplýsingakerfinu. Rammi til að prófa lykilspár um kenningar um bestu varnarkerfi (OD) og kenningu um hreyfanleg skotmörk (MT). Upplýsingaþáttur efnaskiptafræði plantna er í samræmi við OD-kenninguna, en stangast á við meginspá MT-kenningarinnar um efnaskiptadýnamík af völdum jurtaæta. Frá ör- til stórþróunarstigi var jasmónatmerkið greint sem aðalákvarðandi þáttur OD, en etýlenmerkið veitti fínstillingu á jurtaætusértæku svöruninni sem var merkt með MS/MS sameindakerfinu.
Sérstök efnaskiptaefni með fjölbreyttri uppbyggingu eru helstu þátttakendur í aðlögun plantna að umhverfinu, sérstaklega í vörn gegn óvinum (1). Ótrúleg fjölbreytni sérstakra efnaskipta sem finnast í plöntum hefur hvatt til áratuga ítarlegra rannsókna á mörgum þáttum vistfræðilegrar virkni þeirra og hefur myndað langan lista af varnarkenningum plantna, sem eru þróunar- og vistfræðileg þróun samspils plantna og skordýra. Raunvísindalegar rannsóknir veita mikilvæga leiðsögn (2). Hins vegar fylgdu þessar varnarkenningar plantna ekki normatískri leið tilgátulegrar afleiðslu, þar sem lykilspár voru á sama greiningarstigi (3) og voru prófaðar tilraunakennt til að efla næsta lotu fræðilegrar þróunar (4). Tæknilegar takmarkanir takmarka gagnasöfnun við tiltekna efnaskiptaflokka og útiloka ítarlega greiningu á sérhæfðum efnaskiptaefnum, sem kemur í veg fyrir samanburð milli flokka sem er nauðsynlegur fyrir fræðilega þróun (5). Skortur á ítarlegum efnaskiptagögnum og sameiginlegum gjaldmiðli til að bera saman vinnsluflæði efnaskiptarýmisins milli mismunandi plöntuhópa hindrar vísindalegan þroska sviðsins.
Nýjustu þróun á sviði efnaskiptafræði með tandem massagreiningu (MS/MS) getur lýst efnaskiptabreytingum innan og milli tegunda í tiltekinni kerfisgreiningu á ítarlegan hátt og hægt er að sameina þær reikniaðferðir til að reikna út byggingarlíkindi milli þessara flóknu blandna. Forþekking á efnafræði (5). Samsetning háþróaðrar tækni í greiningu og tölvuvinnslu veitir nauðsynlegan ramma fyrir langtímaprófanir á mörgum spám sem gerðar eru af vistfræðilegum og þróunarfræðilegum kenningum um efnaskiptafjölbreytni. Shannon (6) kynnti upplýsingakenninguna í fyrsta skipti í byltingarkenndri grein sinni árið 1948 og lagði þar með grunninn að stærðfræðilegri greiningu upplýsinga, sem hefur verið notuð á mörgum sviðum öðrum en upprunalegu notkun hennar. Í erfðafræði hefur upplýsingakenningunni verið beitt með góðum árangri til að magngreina raðbundnar upplýsingar (7). Í rannsóknum á umritun greinir upplýsingakenninguna heildarbreytingar í umritunarfrumunni (8). Í fyrri rannsóknum notuðum við tölfræðilegan ramma upplýsingakenningarinnar á efnaskiptafræði til að lýsa efnaskiptaþekkingu á vefjastigi í plöntum (9). Hér sameinum við MS/MS-byggða vinnuflæði við tölfræðilegt ramma upplýsingakenningarinnar, sem einkennist af efnaskiptafjölbreytileika í sameiginlegum gjaldmiðli, til að bera saman lykilspár kenningarinnar um varnarkerfi plantna fyrir umbrotsefni sem jurtaætur valda.
Fræðileg rammaverk um varnarkerfi plantna eru yfirleitt gagnkvæmt aðskild og má skipta þeim í tvo flokka: þá sem reyna að útskýra dreifingu plantna-sértækra umbrotsefna út frá varnarstarfsemi, svo sem bestu vörn (OD) (10), hreyfanlegt skotmark (MT) (11) og útlitskenningunni (12), á meðan aðrir leita vélrænna skýringa á því hvernig breytingar á framboði auðlinda hafa áhrif á vöxt plantna og uppsöfnun sérhæfðra umbrotsefna, svo sem kolefnis: næringarefnajafnvægiskenningin (13), vaxtarhraðakenningin (14) og jafnvægiskenningin um vöxt og aðgreiningu (15). Þessar tvær kenningasett eru á mismunandi greiningarstigum (4). Hins vegar ráða tvær kenningar sem varða varnarstarfsemi á virknistigi umræðunni um myndandi og örvandi varnir plantna: OD-kenningin, sem gerir ráð fyrir að plöntur fjárfesti aðeins í dýrum efnavörnum sínum þegar þörf krefur, til dæmis þegar þær eru neyttar. Þegar grasdýr ræðst á, er því, í samræmi við möguleika á framtíðarárás, efnasambandinu með varnarstarfsemi úthlutað (10); Tilgátan um MT leggur til að engin stefnubundin breyting á umbrotsefnum sé til staðar, heldur breytist umbrotsefnið af handahófi, sem skapar möguleikann á að hindra efnaskipta „hreyfimarkmið“ árásargjarnra jurtaæta. Með öðrum orðum, þessar tvær kenningar gera gagnstæðar spár um efnaskiptaendurbyggingu sem á sér stað eftir árás jurtaæta: sambandið milli einstefnu uppsöfnunar umbrotsefna með varnarstarfsemi (OD) og óbeinna efnaskiptabreytinga (MT) (11).
Tilgáturnar um OD og MT fela ekki aðeins í sér breytingar á efnaskiptunum, heldur einnig vistfræðilegar og þróunarfræðilegar afleiðingar uppsöfnunar þessara efnaskipta, svo sem aðlögunarkostnað og ávinning af þessum efnaskiptabreytingum í tilteknu vistfræðilegu umhverfi (16). Þó að báðar tilgáturnar viðurkenni varnarhlutverk sérhæfðra efnaskipta, sem geta verið dýr eða ekki, liggur lykilspáin sem greinir á milli tilgátanna um OD og MT í stefnumörkun hinna efnaskiptabreytinga. Spá um OD-kenninguna hefur fengið mesta tilraunakennda athygli hingað til. Þessar prófanir fela í sér rannsóknir á beinum eða óbeinum varnarhlutverkum mismunandi vefja tiltekinna efnasambanda í gróðurhúsum og náttúrulegum aðstæðum, sem og breytingar á þroskastigi plantna (17-19). Hins vegar, vegna skorts á vinnuflæði og tölfræðilegum ramma fyrir alþjóðlega alhliða greiningu á efnaskiptafjölbreytileika allra lífvera, er enn ólokið að prófa helsta muninn á spánni milli kenninganna tveggja (þ.e. stefna efnaskiptabreytinga). Hér bjóðum við upp á slíka greiningu.
Einn helsti eiginleiki plantnabundinna umbrotsefna er mikill fjölbreytileiki í uppbyggingu þeirra á öllum stigum, allt frá einstökum plöntum og stofnum til svipaðra tegunda (20). Margar megindlegar breytingar á sérhæfðum umbrotsefnum má sjá á stofnstigi, en sterkir eigindlegir munir eru venjulega viðhaldnir á tegundarstigi (20). Þess vegna er fjölbreytileiki í efnaskiptum plantna aðalþáttur í virkni fjölbreytileika, sem endurspeglar aðlögunarhæfni að mismunandi sessum, sérstaklega þeim sessum með mismunandi innrásarmöguleika sérstakra skordýra og algengra jurtaæta (21). Frá því að Fraenkel (22) skrifaði byltingarkennda grein um ástæður fyrir tilvist plantnabundinna umbrotsefna hefur verið litið á samskipti við ýmis skordýr sem mikilvægan valþrýsting og talið er að þessi samskipti hafi mótað plöntur á þróunarskeiðinu. Efnaskiptaferill (23). Mismunur milli tegunda í fjölbreytileika sérhæfðra umbrotsefna getur einnig endurspeglað lífeðlisfræðilegt jafnvægi sem tengist stöðugri og örvandi vörn plantna gegn jurtaætuaðferðum, þar sem tegundirnar tvær eru oft neikvætt tengdar hver við aðra (24). Þó að það geti verið gagnlegt að viðhalda góðri vörn á öllum tímum, þá veita tímabærar efnaskiptabreytingar sem tengjast vörn greinilega kosti þar sem þær gera plöntum kleift að úthluta verðmætum auðlindum til annarra lífeðlisfræðilegra fjárfestinga (19, 24) og forðast þörfina fyrir samlífi. Aukaskaði (25). Að auki geta þessar endurskipulagningar sérhæfðra umbrotsefna, af völdum skordýra sem eru jurtaætur, leitt til skaðlegrar dreifingar í stofninum (26) og geta endurspeglað beinar mælingar á verulegum náttúrulegum breytingum á jasmónsýrumerkinu (JA), sem getur viðhaldist í stofninum. Hátt og lágt JA-merki eru málamiðlun milli varnar gegn jurtaætum og samkeppni við tilteknar tegundir (27). Að auki munu sérhæfðar efnaskiptalíffræðilegar leiðir tapast hratt og umbreytast meðan á þróun stendur, sem leiðir til ójafnrar efnaskiptadreifingar meðal náskyldra tegunda (28). Þessi fjölbrigði geta myndast hratt til að bregðast við breytingum á jurtaætumynstri (29), sem þýðir að sveiflur í jurtaætusamfélagum eru lykilþáttur sem knýr áfram efnaskiptamisleitni.
Hér leystum við sérstaklega eftirfarandi vandamál. (I) Hvernig endurskipuleggur jurtaætur efnaskiptaferlið í plöntunni? (ii) Hverjir eru helstu upplýsingaþættir efnaskiptasveigjanleika sem hægt er að magngreina til að prófa spár um langtíma varnarkenningar? (iii) Hvort eigi að endurforrita efnaskiptaferlið í plöntunni á þann hátt sem er einstakur fyrir árásarmanninn, ef svo er, hvaða hlutverki gegnir plöntuhormón í að sníða sértækt efnaskiptaviðbragð og hvaða umbrotsefni stuðla að tegundasértækni varnar? (iv) Þar sem spár sem gerðar eru af mörgum varnarkenningum geta náð yfir öll stig líffræðilegra vefja, spurðum við hversu samkvæm efnaskiptaviðbrögðin sem orsakast eru frá innri samanburði við samanburð milli tegunda? Í þessu skyni höfum við kerfisbundið rannsakað efnaskiptaferla tóbaksnikótíns í laufi, sem er vistfræðileg fyrirmyndarplanta með rík sérhæfð efnaskipti og er áhrifarík gegn lirfum tveggja innfæddra jurtaæta, Lepidoptera Datura (Ms) (mjög árásargjörn, aðallega étin). Á Solanaceae og Spodoptera littoralis (Sl) eru bómullarlauformar eins konar „ættkvísl“, með hýsilplöntum Solanaceae og öðrum hýslum annarra ættkvísla og fjölskyldna sem eru plöntufæða. Við greindum MS/MS efnaskiptarófið og drógum fram tölfræðilegar lýsingar úr upplýsingakenningunni til að bera saman kenningar um OD og MT. Búum til sértæknikort til að sýna hverjir lykilefnaskiptaefnin eru. Greiningin var útvíkkuð til innfæddrar stofns N. nasi og náskyldra tóbakstegunda til að greina frekar samdreifni milli plöntuhormónaboða og OD örvunar.
Til að fá heildarkort af sveigjanleika og uppbyggingu blaðaefnaskipta í jurtaætu tóbaki, notuðum við áður þróaða greiningar- og útreikningsferla til að safna og sundurgreina ítarlega gögn með mikilli upplausn, óháð MS/MS litrófum úr plöntuútdrætti (9). Þessi óaðgreinda aðferð (kölluð MS/MS) getur smíðað óafturkræf efnasamböndalitróf, sem síðan er hægt að nota fyrir allar greiningar á efnasamböndastigi sem lýst er hér. Þessi sundurgreindu plöntuefnaskiptaefni eru af ýmsum gerðum, samanstanda af hundruðum til þúsunda efnaskiptaefna (um 500-1000-s/MS/MS hér). Hér skoðum við efnaskiptasveigjanleika innan ramma upplýsingakenningar og magngreinum fjölbreytileika og fagmennsku efnaskiptaefnisins út frá Shannon óreiðu efnaskiptatíðnidreifingarinnar. Með því að nota áður útfærða formúlu (8) reiknuðum við safn vísa sem hægt er að nota til að magngreina fjölbreytileika efnaskipta (Hj vísir), sérhæfingu efnaskiptaferils (δj vísir) og efnaskiptasértækni einstaks efnaskiptaefnis (Si vísir). Að auki notuðum við hlutfallslega fjarlægðarplastíkvísitölu (RDPI) til að magngreina efnaskiptaörvun jurtaæta (Mynd 1A) (30). Innan þessa tölfræðilega ramma meðhöndlum við MS/MS litróf sem grunnupplýsingaeiningu og vinnum úr hlutfallslegri gnægð MS/MS í tíðnidreifingarkort og notum síðan Shannon-óreiða til að meta fjölbreytni efnaskipta út frá því. Sérhæfing efnaskipta er mæld með meðalsértækni eins MS/MS litrófs. Þess vegna er aukning á gnægð sumra MS/MS flokka eftir örvun jurtaæta umbreytt í litrófsörvun, RDPI og sérhæfingu, þ.e. aukning á δj vísitölunni, vegna þess að sérhæfðari efnaskiptaefni eru framleidd og hár Si vísitala er framleidd. Lækkun á Hj fjölbreytnivísitölunni endurspeglar að annað hvort fjöldi myndaðra MS/MS er minnkaður eða tíðnidreifing sniðsins breytist í minna einsleita átt, en óvissan í heild sinni er minnkuð. Með útreikningi á Si-stuðlinum er hægt að varpa ljósi á hvaða MS/MS eru örvuð af ákveðnum jurtaætum, en hins vegar hvaða MS/MS bregst ekki við örvuninni, sem er lykilvísir til að greina á milli MT og OD spár.
(A) Tölfræðilegar lýsingar notaðar fyrir jurtaætu (H1 til Hx) MS/MS gagnaörvunarhæfni (RDPI), fjölbreytileika (Hj vísitala), sérhæfingu (δj vísitala) og sértækni efnaskipta (Si vísitala). Aukning á sérhæfingargráðu (δj) gefur til kynna að að meðaltali verði framleidd fleiri sértæk efnaskiptaefni jurtaætu, en minnkun á fjölbreytileika (Hj) gefur til kynna minnkun á framleiðslu efnaskiptaefna eða ójafna dreifingu efnaskiptaefna á dreifingarkortinu. Si gildið metur hvort efnaskiptaefnið er sértækt fyrir tiltekið ástand (hér jurtaæta) eða öfugt viðhaldið á sama stigi. (B) Hugmyndalegt skýringarmynd af varnarkenningunni með því að nota upplýsingakenninguna. OD kenningin spáir því að árás jurtaætu muni auka varnarefnaskiptaefni og þar með auka δj. Á sama tíma minnkar Hj vegna þess að sniðið er endurskipulagt í átt að minni óvissu í efnaskiptaupplýsingum. MT-kenningin spáir því að árás jurtaæta muni valda óstefnubundnum breytingum á efnaskiptunum, sem eykur Hj sem vísbendingu um aukna óvissu í efnaskiptaupplýsingum og veldur handahófskenndri dreifingu Si. Við lögðum einnig til blandaða líkan, besta MT-kenninguna, þar sem sum efnaskiptaefni með hærri varnargildi verða sérstaklega aukin (hátt Si-gildi), en önnur sýna handahófskennd svör (lægra Si-gildi).
Með því að nota lýsingarorð upplýsingakenningarinnar túlkum við OD-kenninguna til að spá fyrir um að breytingar á sérstökum umbrotsefnum af völdum jurtaæta í óörvuðu stöðugu ástandi muni leiða til (i) aukinnar efnaskiptasértækni (Si-vísitölu) sem knýr áfram efnaskiptasértækni (δj-vísitölu) aukningar á ákveðnum sérstökum umbrotsefnahópum með hærra varnargildi, og (ii) minnkunar á fjölbreytileika umbrotsefna (Hj-vísitölu) vegna breytinga á tíðnidreifingu efnaskipta í meiri leptíndreifingu í líkamanum. Fyrir hvert umbrotsefni er búist við skipulegri Si-dreifingu, þar sem umbrotsefnið mun auka Si-gildi í samræmi við varnargildi þess (Mynd 1B). Í samræmi við þetta útskýrum við MT-kenninguna til að spá fyrir um að örvun muni leiða til (i) óstefnubundinna breytinga á umbrotsefnum sem leiða til lækkunar á δj-vísitölunni, og (ii) hækkunar á Hj-vísitölunni vegna aukinnar óvissu í efnaskiptum. Eða handahófskenndar breytingar, sem hægt er að magngreina með Shannon-óreiða í formi almennrar fjölbreytileika. Hvað varðar efnaskiptasamsetningu mun MT-kenningin spá fyrir um handahófskennda dreifingu Si. Þar sem ákveðin umbrotsefni eru við ákveðnar aðstæður við ákveðnar aðstæður, en önnur ekki, og varnargildi þeirra er háð umhverfinu, lögðum við einnig til blandaða varnarlíkan þar sem δj og Hj eru dreifð í tvennt meðfram Si. Við aukningu í allar áttir munu aðeins ákveðnir umbrotsefnahópar, sem hafa hærri varnargildi, auka Si sérstaklega, en aðrir munu hafa handahófskennda dreifingu (Mynd 1B).
Til að prófa endurskilgreinda spá um varnarkenninguna á ás upplýsingakenningarinnar, vökvuðum við sérfræðilirfur (Ms) eða almennar lirfur (Sl) jurtaætu á laufblöðum Nepenthes pallens (Mynd 2A). Með MS/MS greiningu sóttum við 599 ekki-afrituð MS/MS litróf (gagnaskrá S1) úr metanólútdrætti úr laufvef sem safnað var eftir að lirfur höfðu étið. Með því að nota RDPI, Hj og δj vísitölur til að sjá endurskipulagningu upplýsingainnihalds í MS/MS stillingarskrám koma í ljós áhugaverð mynstur (Mynd 2B). Heildarþróunin er sú, eins og lýst er í upplýsingalýsingunni, þegar lirfurnar halda áfram að éta lauf, eykst umfang allrar efnaskiptaendurskipulagningar með tímanum: 72 klukkustundum eftir að jurtaætan étur, eykst RDPI verulega. Í samanburði við óskemmda samanburðarhópinn minnkaði Hj verulega, sem stafaði af aukinni sérhæfingu efnaskiptaferilsins, sem var magngreind með δj vísitölunni. Þessi augljósa þróun er í samræmi við spár OD-kenningarinnar en stangast á við meginspár MT-kenningarinnar, sem telur að tilviljunarkenndar (stefnulausar) breytingar á umbrotsefnamagni séu notaðar sem varnarfellubúningur (Mynd 1B). Þó að innihald munnseytis (OS) og fæðuhegðun þessara tveggja jurtaæta séu ólík, þá leiddi bein fóðrun þeirra til svipaðra breytinga á stefnu Hj og δj á 24 klukkustunda og 72 klukkustunda uppskerutímabilunum. Eini munurinn kom fram við 72 klukkustundir af RDPI. Í samanburði við það sem orsakaðist af Ms-fóðrun voru heildarumbrotin sem framkölluð voru af Sl-fóðrun hærri.
(A) Tilraunagerð: Svín (S1) eða sérfræðingar (Ms) eru fóðraðir með afsöltuðum laufum af könnuplöntum, en fyrir hermt jurtaætuástand er heildarfjöldi Ms (W + OSM) notaður til að meðhöndla stungun á stöðluðum laufstöðusárum. S1 (W + OSSl) lirfur eða vatn (W + W). Viðmiðunarhópurinn (C) er óskemmt laufblað. (B) Örvunarhæfni (RDPI samanborið við viðmiðunartöflu), fjölbreytileiki (Hj vísitala) og sérhæfingarvísitala (δj vísitala) reiknuð fyrir sérstaka efnaskiptakortið (599 MS/MS; gagnaskrá S1). Stjörnur gefa til kynna marktækan mun á beinni fóðrun jurtaætunnar og viðmiðunarhópsins (t-próf ​​nemenda með paraðri t-prófi, *P < 0,05 og ***P < 0,001). ns, ekki mikilvægt. (C) Tímaupplausnarvísitala aðal- (blár kassi, amínósýra, lífræn sýra og sykur; gagnaskrá S2) og sérstaks efnaskiptarófs (rauður kassi 443 MS/MS; gagnaskrá S1) eftir hermt jurtaætuát. Litröndin vísar til 95% öryggisbils. Stjarnan gefur til kynna marktækan mun á meðferð og samanburðarhópi [kvaðratísk dreifigreining (ANOVA), og síðan heiðarlega marktækur munur Tukey (HSD) fyrir margfalda samanburði eftir á, *P<0,05, **P<0,01 og *** P <0,001]. (D) Sérhæfing dreifimynda og sérstakra efnaskiptaprófíla (endurtekin sýni með mismunandi meðferðum).
Til að kanna hvort endurgerð á efnaskiptastigi vegna jurtaæta endurspeglast í breytingum á magni einstakra umbrotsefna, einbeittum við okkur fyrst að umbrotsefnum sem áður höfðu verið rannsökuð í laufum Nepenthes pallens með sannaða jurtaætuþol. Fenólamíð eru hýdroxýsinnamíð-pólýamín samtengingar sem safnast fyrir við jurtaætuferli skordýra og eru þekktar fyrir að draga úr afköstum skordýra (32). Við leituðum að forverum samsvarandi MS/MS og teiknuðum uppsafnaða hvarfhraða þeirra (Mynd S1). Ekki kemur á óvart að fenólafleiður sem taka ekki beinan þátt í vörn gegn jurtaætum, svo sem klórógensýru (CGA) og rútín, eru niðurstýrðar eftir jurtaætu. Þvert á móti geta jurtaætur gert fenólamíð mjög öflug. Stöðug fóðrun þessara tveggja jurtaæta leiddi til næstum sama örvunarrófs fenólamíða, og þetta mynstur var sérstaklega augljóst fyrir de novo myndun fenólamíða. Sama fyrirbæri verður vart við þegar 17-hýdroxýgeranýl nonandíól díterpen glýkósíð (17-HGL-DTG) ferillinn er skoðaður, sem framleiðir fjölda asýklískra díterpena með virkum jurtaætuhemjandi virkni (33), þar sem Ms fóðrun með Sl kveikti svipaða tjáningarferil (mynd S1)).
Hugsanlegur ókostur við beinar fóðrunartilraunir fyrir jurtaætur er munurinn á blaðneysluhraða og fóðrunartíma jurtaæta, sem gerir það erfitt að útiloka áhrif jurtaæta sem eru sértæk fyrir sár og jurtaætur. Til að leysa betur sértækni jurtaætutegunda í örvuðum efnaskiptaviðbrögðum laufanna, hermdum við fóðrun Ms og Sl lirfa með því að setja nýsöfnuð OS (OSM og OSS1) strax á staðlaða stunguna W á samræmdum laufstöðum. Þessi aðferð kallast W + OS meðferð og hún staðlar örvunina með því að tímasetja nákvæmlega upphaf viðbragðsins sem jurtaætan framkallar án þess að valda ruglingslegum áhrifum af mismunandi hraða eða magni vefjataps (Mynd 2A) (34). Með því að nota MS/MS greiningar- og útreikningsferlið fengum við 443 MS/MS litróf (gagnaskrá S1), sem sköruðust við litrófin sem áður voru sett saman úr beinum fóðrunartilraunum. Upplýsingakenningargreining þessa MS/MS gagnasafns sýndi að endurforritun blaðsérhæfðra umbrotsefna með því að herma eftir jurtaætum sýndi OS-sértækar örvanir (Mynd 2C). Sérstaklega, samanborið við OSS1 meðferð, olli OSM aukningu á sérhæfingu umbrotsefna eftir 4 klukkustundir. Það er vert að taka fram að samanborið við tilraunagagnasafnið um beina fóðrun jurtaæta, var efnaskiptahraðafræðin sýnd í tvívíðu rúmi með því að nota Hj og δj sem hnit og stefnubreytingu umbrotsefnasérhæfingarinnar sem svar við hermdri meðferð jurtaætu með tímanum jókst stöðugt (Mynd 2D). Á sama tíma magngreindum við innihald amínósýra, lífrænna sýra og sykra (gagnaskrá S2) til að kanna hvort þessi markvissa aukning á sérþekkingu umbrotsefna stafi af endurskipulagningu miðlægs kolefnisumbrots sem svar við hermdri jurtaætu (Mynd S2). Til að útskýra þetta mynstur betur fylgdumst við frekar með efnaskiptauppsöfnunarhraða áður ræddra fenólamíð- og 17-HGL-DTG ferla. Örvun sértækrar OS hjá jurtaætum umbreytist í mismunandi endurröðunarmynstur innan fenólamíðefnaskipta (Mynd S3). Fenólamíð sem innihalda kúmarín og koffínýleiningar eru helst örvuð af OSS1, en OSM virkja sértæka örvun ferúlýltenginga. Fyrir 17-HGL-DTG leiðina greindist mismunandi OS-örvun með malónýleringu og dímalónýleringarafurðum niðurstreymis (Mynd S3).
Næst rannsökuðum við sveigjanleika umritunar af völdum OS með því að nota tímabundið örflögugagnasett, sem hermir eftir notkun OSM til að meðhöndla laufblöð rósettuplöntunnar hjá jurtaætum. Hreyfifræði sýnatökunnar skarast í grundvallaratriðum við hraðafræðina sem notuð var í þessari efnaskiptarannsókn (35). Í samanburði við endurskipulagningu efnaskipta þar sem sveigjanleiki efnaskipta eykst sérstaklega með tímanum, sjáum við tímabundnar umritunarsprungur í laufblöðum sem eru framkallaðar af Ms, þar sem örvun umritunar (RDPI) og sérhæfing (δj) eru 1. Það var marktæk aukning í klukkustundum og fjölbreytni (Hj) á þessum tímapunkti, tjáning BMP1 minnkaði verulega, og síðan slökun á sérhæfingu umritunar (Mynd S4). Efnaskiptagenafjölskyldur (eins og P450, glýkósýltransferasi og BAHD asýltransferasi) taka þátt í ferlinu við að setja saman sérstök umbrotsefni úr byggingareiningum sem eru fengnar úr frumefnaskiptum, samkvæmt fyrrnefndri snemma mikilli sérhæfingarlíkani. Sem dæmisögu var fenýlalanínferillinn greindur. Greiningin staðfesti að kjarnagenin í efnaskiptum fenólamíða eru mjög OS-örvuð í jurtaætum samanborið við óaðlaðar plöntur og eru nátengd í tjáningarmynstri þeirra. Umritunarþátturinn MYB8 og byggingargenin PAL1, PAL2, C4H og 4CL í uppstreymi þessarar ferils sýndu snemmbúna upphaf umritunar. Asýltransferasar sem gegna hlutverki í lokasamsetningu fenólamíða, svo sem AT1, DH29 og CV86, sýna langvarandi uppstýringarmynstur (Mynd S4). Ofangreindar athuganir benda til þess að snemmbúin upphaf sérhæfingar umritunar og síðari aukning sérhæfingar í efnaskiptum séu samtengd ferli, sem gæti stafað af samstilltu stjórnkerfi sem hrinda af stað öflugri varnarviðbrögðum.
Endurskipulagningin í boðleiðum plantnahormóna virkar sem stjórnlag sem samþættir upplýsingar frá jurtaætum til að endurforrita lífeðlisfræði plantna. Eftir hermunina á jurtaætum mældum við uppsafnaða virkni lykilflokka jurtahormóna og sýndum tímabundna samtjáningu á milli þeirra [Pearson fylgnistuðull (PCC) > 0,4] (Mynd 3A). Eins og búist var við eru jurtahormón sem tengjast lífmyndun tengd innan samtjáningarnets jurtahormóna. Að auki er efnaskiptasértækni (Si vísitala) kortlögð á þetta net til að varpa ljósi á jurtahormón sem eru örvuð af mismunandi meðferðum. Tvö meginsvið sértækrar svörunar jurtaæta eru dregin upp: annað er í JA klasanum, þar sem JA (líffræðilega virka form þess JA-Ile) og aðrar JA afleiður sýna hæstu Si stig; hitt er etýlen (ET). Gibberellín sýndi aðeins miðlungsmikla aukningu í sértækni jurtaæta, en önnur jurtahormón, svo sem cýtókínín, auxín og abscisínsýra, höfðu lága örvunarsértækni fyrir jurtaætur. Í samanburði við notkun W + W eitt og sér, er hægt að umbreyta mögnun hámarksgildis JA afleiða með OS forritinu (W + OS) í grundvallaratriðum í sterkan sértækan vísbendingu um JA. Óvænt er vitað að OSM og OSS1 með mismunandi innihaldi örvandi þátta valda svipaðri uppsöfnun JA og JA-Ile. Ólíkt OSS1 er OSM sérstaklega og sterklega örvað af OSM, en OSS1 magnar ekki svörun grunnsára (Mynd 3B).
(A) Greining á samhliða tjáningarneti byggð á PCC útreikningi á hermun á hvarfhraða uppsöfnunar plöntuhormóna af völdum jurtaætu. Hnútur táknar eitt plöntuhormón og stærð hnútarins táknar Si vísitöluna sem er sértæk fyrir plöntuhormónið milli meðferða. (B) Uppsöfnun JA, JA-Ile og ET í laufblöðum af völdum mismunandi meðferða, gefin til kynna með mismunandi litum: apríkósu, W + OSM; blátt, W + OSSl; svart, W + W; grátt, C (viðmiðun). Stjörnur gefa til kynna marktækan mun á meðferð og viðmiðun (tvíhliða ANOVA fylgt eftir með Tukey HSD post hoc margfeldis samanburði, *** P <0,001). Upplýsingakenningargreining á (C)697 MS/MS (gagnaskrá S1) í JA lífmyndun og skertu skynjunarrófi (irAOC og irCOI1) og (D)585 MS/MS (gagnaskrá S1) í ETR1 með skertu ET merki. Tvær hermdar meðferðir með jurtaætu virkjuðu plöntulínur og tómar burðarefnis (EV) viðmiðunarplöntur. Stjörnur gefa til kynna marktækan mun á W+OS meðferð og óskemmdum samanburðarhópi (tvíhliða ANOVA fylgt eftir með Tukey HSD post hoc margfaldri samanburði, *P<0,05, **P<0,01 og ***P<0,001). (E) Dreifð gröf sem sýna dreifða andstöðu við sérhæfingu. Litirnir tákna mismunandi erfðabreyttar stofna; táknin tákna mismunandi meðferðaraðferðir: þríhyrningur, W + OSS1; rétthyrningur, W + OSM; hringur C
Næst notum við erfðabreyttan stofn af veikluðum Nepenthes (irCOI1 og sETR1) í lykilþrepum í myndun JA og ET (irAOC og irACO) og skynjun (irCOI1 og sETR1) til að greina efnaskipti þessara tveggja plöntuhormóna á jurtaætur. Hlutfallslegt framlag endurforritunar. Í samræmi við fyrri tilraunir staðfestum við örvun á jurtaætur-OS í tómum burðarplöntum (EV) (Mynd 3, C til D) og heildarlækkun á Hj vísitölunni af völdum OSM, en δj vísitalan jókst. Viðbrögðin eru meira áberandi en svörunin sem OSS1 kveikti á. Tveggja lína graf sem notar Hj og δj sem hnit sýnir sértæka afstýringu (Mynd 3E). Augljósasta þróunin er sú að í stofnum sem skortir JA merki eru breytingar á efnaskiptum og sérhæfingu af völdum jurtaætur næstum alveg útrýmt (Mynd 3C). Hins vegar dregur þögul ET skynjun í sETR1 plöntum, þó að heildaráhrifin á breytingar á efnaskiptum jurtaæta séu mun minni en áhrif JA boðleiða, úr mismuninum á Hj og δj vísitölum milli OSM og OSS1 örvunar (mynd 3D og mynd S5). Þetta bendir til þess að auk kjarnahlutverks JA merkjasendinga, þá þjónar ET merkjasending einnig sem fínstilling á tegundasértækri efnaskiptasvörun jurtaæta. Í samræmi við þessa fínstillingu varð engin breyting á heildar umbrotsefnaörvun í sETR1 plöntum. Hins vegar, samanborið við sETR1 plöntur, ollu irACO plöntur svipaðri heildarstyrk efnaskiptabreytinga af völdum jurtaæta, en sýndu marktækt mismunandi Hj og δj stig milli OSM og OSS1 áskorana (mynd S5).
Til að bera kennsl á sérhæfð umbrotsefni sem hafa mikilvægt framlag til tegundarsértækrar svörunar jurtaæta og fínstilla framleiðslu þeirra með ET merkjum, notuðum við áður þróaða MS/MS aðferð. Þessi aðferð byggir á tvíþyrpingaraðferð til að endurálykta efnaskiptafjölskylduna út frá MS/MS brotum [stöðluð punktafurð (NDP)] og líkindastigi byggt á hlutlausu tapi (NL). MS/MS gagnasafn sem búið var til með greiningu á ET erfðabreyttum línum framleiddi 585 MS/MS (gagnaskrá S1), sem var aðskilið með því að flokka þær í sjö megin MS/MS einingar (M) (Mynd 4A). Sumar þessara eininga eru þéttpakkaðar með áður einkenndum sérstökum umbrotsefnum: til dæmis eru M1, M2, M3, M4 og M7 rík af ýmsum fenólafleiðum (M1), flavonoid glýkósíðum (M2), asýlsykrum (M3 og M4) og 17-HGL-DTG (M7). Að auki eru efnaskiptaupplýsingar (Si vísitala) einstaks umbrotsefnis í hverri einingu reiknaðar út og Si dreifingu þess má sjá á innsæi. Í stuttu máli einkennast MS/MS litróf sem sýna mikla jurtaætu- og arfgerðarsértækni af háum Si gildum og tölfræði um kurtosis gefur til kynna dreifingu feldar á hægra halahorni. Ein slík dreifing með magra kolloidum greindist í M1, þar sem fenólamíð sýndi hæsta Si hlutfallið (Mynd 4B). Áður nefnt jurtaætuörvandi 17-HGL-DTG í M7 sýndi miðlungs Si stig, sem bendir til miðlungs mismunandi stjórnunar milli tveggja OS gerða. Aftur á móti eru flest sérhæfð umbrotsefni sem myndast stöðugt, svo sem rutín, CGA og asýlsykur, meðal lægstu Si stiganna. Til að kanna betur byggingarflækjustig og Si dreifingu milli sérstakra umbrotsefna var sameindakerfi smíðað fyrir hverja einingu (Mynd 4B). Mikilvæg spá um OD-kenninguna (samantekt á mynd 1B) er að endurskipulagning sérstakra umbrotsefna eftir jurtaætu ætti að leiða til einstefnubreytinga í umbrotsefnum með hátt varnargildi, sérstaklega með því að auka sértækni þeirra (öfugt við handahófskennda dreifingu) Varnarumbrotsefni eins og spáð er fyrir um með MT-kenningunni. Flest fenólafleiður sem safnast fyrir í M1 tengjast virkni sinni hnignun á skordýraafköstum (32). Þegar Si-gildi í M1 umbrotsefnum voru borin saman milli örvuðu laufblaðanna og blaða sem voru í samanburðarplöntunum eftir 24 klukkustundir, sáum við að efnaskiptasértækni margra umbrotsefna eftir jurtaætu skordýr hefur marktæka vaxandi tilhneigingu (mynd 4C). Sértæk aukning á Si-gildi greindist aðeins í varnarfenólamíðum, en engin aukning á Si-gildi greindist í öðrum fenólum og óþekktum umbrotsefnum sem eru til staðar samhliða í þessari einingu. Þetta er sérhæft líkan sem tengist OD-kenningunni. Helstu spár um efnaskiptabreytingar af völdum jurtaæta eru samkvæmar. Til að prófa hvort þessi sérstaða fenólamíðlitrófsins væri örvuð af OS-sértækum ET, teiknuðum við Si vísitölu umbrotsefnisins og ollu mismunandi tjáningargildi milli OSM og OSS1 í EV og sETR1 erfðagerðunum (Mynd 4D). Í sETR1 minnkaði fenamíð-örvaður munur á OSM og OSS1 verulega. Tvíþyrpingaraðferðin var einnig notuð á MS/MS gögn sem safnað var í stofnum með ófullnægjandi JA til að álykta um helstu MS/MS einingar sem tengjast JA-stýrðri efnaskiptasérhæfingu (Mynd S6).
(A) Niðurstöður klasagreiningar 585 MS/MS byggðar á sameiginlegum brotum (NDP líkindi) og sameiginlegum hlutlausum tapi (NL líkindi) leiða til þess að einingin (M) er í samræmi við þekkta efnasambandsfjölskyldu, eða með óþekktri eða illa umbrotinni umbrotsefnasamsetningu. Við hliðina á hverri einingu er sýnd sértæk dreifing (Si) umbrotsefnisins (MS/MS). (B) Mátbundið sameindakerfi: Hnútar tákna MS/MS og brúnir, NDP (rautt) og NL (blátt) MS/MS stig (viðmiðunarmörk, > 0,6). Stigað sértækni efnaskipta (Si) litað út frá einingunni (vinstri) og varpað á sameindakerfið (hægri). (C) Eining M1 af EV plöntu í stöðugu (viðmiðunar) og framkallaðu ástandi (hermt jurtaæta) eftir 24 klukkustundir: sameindakerfismynd (Si gildi er hnútastærð, varnarfenólamíð er auðkennt með bláu). (D) M1 sameindakerfisrit litrófslínunnar sETR1 með skertri EV og ET skynjun: fenólsambandið sem græni hringhnúturinn táknar og marktækur munur (P gildi) á milli W + OSM og W + OSS1 meðferða sem hnútastærð. CP, N-kaffeóýl-týrósín; CS, N-kaffeóýl-spermidín; FP, N-ferúlsýruester-þvagsýra; FS, N-ferúlýl-spermidín; CoP, N', N“-Kúmarólýl-týrósín; DCS, N', N”-díkaffeóýl-spermidín; CFS, N', N”-kaffeóýl, ferúlóýl-spermidín; Lycium barbarum í úlfaberja-Son; Nick. O-AS, O-asýlsykur.
Við útvíkkuðum greininguna enn frekar frá einni veiklaðri Nepenthes arfgerð yfir á náttúrulega stofna, þar sem sterkar innangreiningarbreytingar á magni JA í jurtaætum og magni sértækra umbrotsefna hafa áður verið lýstar í náttúrulegum stofnum (26). Notum þetta gagnasafn til að ná yfir 43 kímfrumur. Þessar kímfrumur samanstanda af 123 tegundum plantna frá N. pallens. Þessar plöntur voru teknar úr fræjum sem safnað var í mismunandi innfæddum búsvæðum í Utah, Nevada, Arisóna og Kaliforníu (Mynd S7), við reiknuðum fjölbreytileika umbrotsefna (hér kallað stofnstig) β fjölbreytileika) og sérhæfingu af völdum OSM. Í samræmi við fyrri rannsóknir sáum við fjölbreytt úrval af efnaskiptabreytingum meðfram Hj og δj ásunum, sem bendir til þess að kímfrumur hafa verulegan mun á sveigjanleika efnaskiptaviðbragða sinna við jurtaætum (Mynd S7). Þessi skipulagning minnir á fyrri athuganir um breytilegt svið JA breytinga af völdum jurtaæta og hefur viðhaldið mjög háu gildi í einum stofni (26, 36). Með því að nota JA og JA-Ile til að prófa heildarfylgni milli Hj og δj, komumst við að því að það er marktæk jákvæð fylgni milli JA og fjölbreytileika- og sérhæfingarvísitölu umbrotsefna β (Mynd S7). Þetta bendir til þess að ósamræmið í örvun JA sem greinist á stofnstigi af völdum jurtaæta gæti stafað af lykil efnaskiptafjölbreytileika sem orsakast af vali úr skordýrajurtaætum.
Fyrri rannsóknir hafa sýnt að tóbakstegundir eru mjög mismunandi að gerð og hlutfallslega háðar framkölluðum og myndandi efnaskiptavörnum. Talið er að þessar breytingar á merkjasendingum og varnargetu gegn jurtaætum séu stjórnaðar af skordýrastofnþrýstingi, lífsferli plantna og framleiðslukostnaði varnar í þeim sess þar sem tiltekin tegund vex. Við rannsökuðum samræmi endurgerðar blaðaefnaskipta sem framkallaðar eru af jurtaætum sex tegunda af tegundinni Nicotiana sem eru upprunnar í Norður- og Suður-Ameríku. Þessar tegundir eru náskyldar Nepenthes Norður-Ameríku, þ.e. Nicolas Bociflo, N. nicotinis, Nicotiana n. attenuated grass, Nicotiana tabacum, línulegu tóbaki, tóbaki (Nicotiana spegazzinii) og tóbakslauftóbaki (Nicotiana obtusifolia) (Mynd 5A) (37). Sex af þessum tegundum, þar á meðal vel skilgreinda tegundin N. please, eru einærar plöntur af petunia-klasanum, og obtusifolia N. eru fjölærar plöntur af systurklasanum Trigonophyllae (38). Í kjölfarið var W + W, W + OSM og W + OSS1 örvun framkvæmd á þessum sjö tegundum til að rannsaka efnaskiptaendurröðun fæðuöflunar skordýra á tegundastigi.
(A) Ættarfræðilegt tré byggt á hámarkslíkindum [fyrir kjarna glútamínmyndun (38)] og landfræðilegri dreifingu sjö náskyldra Nicotiana tegunda (mismunandi litir) (37). (B) Punktmynd af sérhæfðri fjölbreytni fyrir efnaskiptaferla sjö Nicotiana tegunda (939 MS/MS; gagnaskrá S1). Á tegundastigi er fjölbreytni efnaskipta neikvætt tengd sérhæfingargráðu. Greining á tegundastigi fylgni milli efnaskiptafjölbreytni og sérhæfingar og JA uppsöfnunar er sýnd á mynd 2. S9. Litur, mismunandi gerðir; þríhyrningur, W + OSS1; rétthyrningur, W + OSM; (C) Nicotiana JA og JA-Ile hreyfifræði eru raðað eftir OS örvunarvídd (tvíhliða ANOVA og Tukey HSD eftir margfalda samanburð, * P <0,05, ** P <0,01 og * ** Til samanburðar á W + OS og W + W, P <0,001). Kassmynd af (D) fjölbreytni og (E) sérhæfingu hverrar tegundar eftir hermun á jurtaætu og metýl JA (MeJA). Stjörnan gefur til kynna marktækan mun á W + OS og W + W eða lanólín plús W (Lan + W) eða Lan plús MeJA (Lan + MeJa) og Lan samanburðarhópnum (tvíhliða dreifigreining, fylgt eftir af Tukey's HSD eftir á margfaldri samanburðarrannsókn, *P < 0,05, **P < 0,01 og ***P < 0,001).
Með því að nota tvöfalda klasaaðferðina greindum við 9 einingar af 939 MS/MS (gagnaskrá S1). Samsetning MS/MS, sem endurskipulögð var með mismunandi meðferðum, er mjög mismunandi eftir einingum milli tegunda (Mynd S8). Með því að sjá Hj (hér vísað til sem tegundastigs γ-fjölbreytni) og δj kemur í ljós að mismunandi tegundir safnast saman í mjög mismunandi hópa í efnaskiptarýminu, þar sem tegundaskipting er venjulega áberandi en örvun. Fyrir utan N. linear og N. obliquus sýna þær breitt breytilegt svið örvunaráhrifa (Mynd 5B). Aftur á móti hafa tegundir eins og N. purpurea og N. obtusifolia minna augljós efnaskiptaviðbrögð við meðferð, en efnaskiptaferlið er fjölbreyttara. Tegundarsértæk dreifing örvuðu efnaskiptaviðbragðanna leiddi til marktækrar neikvæðrar fylgni milli sérhæfingar og gamma-fjölbreytni (PCC = -0,46, P = 4,9×10-8). Breytingar á JA-gildum vegna OS eru jákvætt tengdar sérhæfingu umbrotsefna og neikvætt tengdar fjölbreytileika efnaskipta-gamma sem hver tegund sýnir (Mynd 5B og Mynd S9). Það er vert að taka fram að tegundirnar sem daglega eru kallaðar „merkjasvörunar“ tegundir á mynd 5C, eins og Nepenthes nematodes, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acute og Nepenthes attenuated, ollu verulegum einkennum eftir 30 mínútur. Nýleg OS-sértæk JA og JA-Ile faraldur, en aðrar bakteríur sem kallast „merkjaósvarandi“, eins og Nepenthes mills, Nepenthes powdery og N. obtusifolia, sýna aðeins JA-Ile Edge örvun án nokkurrar OS-sértækni (Mynd 5C). Á efnaskiptastigi, eins og áður hefur komið fram, fyrir veiklað Nepenthes, sýndu merkjasvörunarefnin OS-sértækni og juku δj verulega, en minnkuðu Hj. Þessi OS-sértæka undirbúningsáhrif greindust ekki í tegundum sem flokkast sem merkjaóhvarfgjarnar tegundir (Mynd 5, D og E). OS-sértæk umbrotsefni eru oftar sameiginleg milli tegunda sem bregðast við merkjum, og þessi merkjasamsetningar flokkast með tegundum með veikari merkjasvörun, en tegundir með veikari merkjasvörun sýna minni samvirkni (Mynd S8). Þessi niðurstaða bendir til þess að OS-sértæk örvun JA og OS-sértæk endurskipulögn niðurstreymis umbrotsefnisins séu tengd á tegundastigi.
Næst notuðum við lanólínmauk sem innihélt metýl JA (MeJA) til að meðhöndla plöntur til að kanna hvort þessir tengimátar séu takmarkaðir af framboði á JA sem notað er af utanaðkomandi JA, sem verður í umfrymi plantna. Hröð afesterun er JA. Við fundum sömu þróun í stigvaxandi breytingu frá tegundum sem bregðast við merkjum yfir í tegundir sem ekki bregðast við merkjum, af völdum stöðugs framboðs af JA (Mynd 5, D og E). Í stuttu máli endurforritaði MeJA meðferð verulega umbrotsefni línulegra þráðorma, N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens og N. mikimotoi, sem leiddi til verulegrar aukningar á δj og lækkunar á Hj. N. purpurea sýndi aðeins aukningu á δj, en ekki Hj. N. obtusifolia, sem áður hefur verið sýnt fram á að safnar afar litlu magni af JA, bregst einnig illa við MeJA meðferð hvað varðar endurskipulagningu umbrotsefna. Þessar niðurstöður benda til þess að JA framleiðsla eða merkjasending sé lífeðlisfræðilega takmörkuð hjá tegundum sem ekki bregðast við merkjum. Til að prófa þessa tilgátu rannsökuðum við fjórar tegundir (N. pallens, N. mills, N. pink og N. microphylla) sem voru framkallaðar af W + W, W + OSM og W + OSS1 umritun (39). Í samræmi við mynstur umbreytingar efnaskipta eru tegundirnar vel aðskildar í umritunarrýminu, þar sem N. attenuated sýndi hæsta OS-framkallaða RDPI, en N. gracilis hafði lægsta (Mynd 6A). Hins vegar kom í ljós að fjölbreytileiki umritunar sem N. oblonga framkallaði var sá lægsti meðal fjögurra tegundanna, öfugt við hæsta efnaskiptafjölbreytileika N. oblonga sem áður hefur verið sýnt fram á hjá sjö tegundum. Fyrri rannsóknir hafa sýnt að safn gena sem tengjast snemmbærum varnarmerkjum, þar á meðal JA merkjum, skýrir sértækni snemmbærra varnarviðbragða sem framkallaðar eru af jurtaætutengdum örvum í Nicotiana tegundum (39). Samanburður á JA merkjaleiðum milli þessara fjögurra tegunda leiddi í ljós áhugavert mynstur (Mynd 6B). Flest gen í þessari ferli, eins og AOC, OPR3, ACX og COI1, sýndu tiltölulega hátt örvunarstig í þessum fjórum tegundum. Hins vegar breytir lykilgen, JAR4, JA í líffræðilega virka mynd af uppsöfnuðum JA-Ile umritum, og umritunarstig þess er mjög lágt, sérstaklega í N. mills, Nepenthes pieris og N. microphylla. Þar að auki greindist aðeins umrit annars gens AOS ekki í N. bifidum. Þessar breytingar á genatjáningu gætu verið ábyrgar fyrir þeim miklu svipgerðum sem valda lágri JA framleiðslu í merkjaónæmum tegundum og örvun N. gracilis.
(A) Greining á upplýsingakenningu um endurforritun snemmbúinna umritunarviðbragða fjögurra skyldra tóbakstegunda sem teknar voru sýni af 30 mínútum eftir að jurtaæta var örvuð. RDPI er reiknað með því að bera saman laufin sem jurtaætan hefur örvað með blöðum sem eru örvuð með blöðum sem eru örvuð með blöðum sem eru örvuð með blöðum og sárviðmiðunarhópnum. Litirnir gefa til kynna mismunandi tegundir og táknin gefa til kynna mismunandi meðferðaraðferðir. (B) Greining á genatjáningu í JA merkjaleiðum meðal fjögurra tegunda. Einfölduð JA leiðin er sýnd við hliðina á kassaritinu. Mismunandi litir gefa til kynna mismunandi vinnsluaðferðir. Stjarnan gefur til kynna að marktækur munur er á W + OS meðferðinni og W + W viðmiðunarhópnum (fyrir Student's t-próf ​​fyrir paraðan mun, *P<0,05, **P<0,01 og ***P<0,001). OPDA, 12-oxófýtódíenósýra; OPC-8: 0,3-oxó-2(2′(Z)-pentenýl)-sýklópentan-1-oktanósýra.
Í síðasta hlutanum rannsökuðum við hvernig tegundasértæk endurgerð skordýra á efnaskiptaferlum mismunandi plantna getur verið ónæm fyrir jurtaætum. Fyrri rannsóknir lögðu áherslu á Nicotiana ættkvíslina. Ónæmi þeirra gegn Ms og lirfum er mjög mismunandi (40). Hér rannsökuðum við tengslin milli þessa líkans og efnaskiptaplasts þeirra. Með því að nota ofangreindar fjórar tóbakstegundir og prófa fylgni milli fjölbreytileika og sérhæfingar efnaskiptaferla af völdum jurtaæta og ónæmis plantna gegn Ms og Sl, komumst við að því að ónæmi, fjölbreytileiki og sérhæfing gagnvart almenna Sl eru jákvætt tengd, en fylgni milli ónæmis gegn sérfræðingum og sérhæfingu er veik, og fylgni við fjölbreytileika er ekki marktæk (Mynd S10). Hvað varðar S1 ónæmi, þá höfðu bæði veiklað N. chinensis og N. gracilis, sem áður hafði verið sýnt fram á að sýna bæði JA merkjasendingarstig og efnaskiptaplasts, mjög mismunandi svörun við örvun jurtaæta og þau sýndu einnig svipaða mikla ónæmi. Kyn.
Á síðustu sextíu árum hefur kenningin um varnarkerfi plantna veitt fræðilegan ramma sem vísindamenn hafa byggt á og spáð fyrir um töluvert fjölda þróunar og virkni sérhæfðra umbrotsefna plantna. Flestar þessara kenninga fylgja ekki venjulegri aðferð sterkra ályktana (41). Þær leggja til lykilspár (3) á sama greiningarstigi. Þegar prófun lykilspár gerir kleift að greina tilteknar kenningar mun þetta gera það að verkum að sviðinu er að þróast áfram. Verður stutt, en hafnað öðrum (42). Í staðinn gerir nýja kenningin spár á mismunandi greiningarstigum og bætir við nýju lagi af lýsandi sjónarmiðum (42). Hins vegar er auðvelt að útskýra tvær kenningar sem lagðar eru til á virknistigi, MT og OD, sem mikilvægar spár um sérhæfðar efnaskiptabreytingar af völdum jurtaæta: OD-kenningin telur að breytingar í sérhæfðu efnaskipta-„rými“ séu mjög stefnubundnar. MT-kenningin telur að þessar breytingar verði óstefnubundnar og staðsettar af handahófi í efnaskiptarýminu og hafi tilhneigingu til að hafa umbrotsefni með hátt varnargildi. Fyrri rannsóknir á OD- og MT-spám hafa verið prófaðar með því að nota þröngt sett af fyrirfram „varnar“-efnasamböndum. Þessar efnaskiptamiðaðar prófanir útiloka getu til að greina umfang og feril endurskipulagningar efnaskipta við jurtaætu og leyfa ekki prófanir innan samræmds tölfræðilegs ramma til að krefjast lykilspáa sem hægt er að líta á sem heild til að magngreina breytingar á efnaskiptum plantna. Hér notuðum við nýstárlega tækni í efnaskiptafræði byggða á tölvureiknifræðilegri MS og framkvæmdum affellingar MS greiningu með almennum lýsingum upplýsingakenningarinnar til að prófa muninn á þessum tveimur sem lagðar eru til á alþjóðlegu efnaskiptafræðistigi. Lykilspá þessarar kenningar. Upplýsingakenningin hefur verið notuð á mörgum sviðum, sérstaklega í samhengi við rannsóknir á líffræðilegum fjölbreytileika og næringarefnaflæði (43). Hins vegar, eftir því sem við best vitum, er þetta fyrsta notkunin sem notuð er til að lýsa efnaskiptaupplýsingarými plantna og leysa vistfræðileg vandamál sem tengjast tímabundnum efnaskiptabreytingum sem bregðast við umhverfisvísbendingum. Sérstaklega liggur hæfni þessarar aðferðar í getu hennar til að bera saman mynstur innan og milli plantnategunda til að kanna hvernig jurtaætur hafa þróast frá mismunandi tegundum til stórþróunarmynstra milli tegunda á mismunandi þróunarstigum. Efnaskipti.
Aðalþáttagreining (e. Principal component analysis, PCA) breytir fjölbreytu gagnasafni í víddarminnkunarrými svo hægt sé að útskýra meginþróun gagnanna, þannig að hún er venjulega notuð sem könnunartækni til að greina gagnasafnið, eins og affellingarumbrot. Hins vegar mun víddarminnkun tapa hluta af upplýsingainnihaldi gagnasafnsins, og PCA getur ekki veitt megindlegar upplýsingar um eiginleika sem eru sérstaklega viðeigandi fyrir vistfræðikenningar, svo sem: hvernig jurtaætur endurskilgreina fjölbreytileika á sérhæfðum sviðum (til dæmis auðlegð, dreifingu og gnægð) umbrotsefna? Hvaða umbrotsefni eru spámenn um framkallað ástand tiltekins jurtaætu? Frá sjónarhóli sértækni, fjölbreytileika og framkallanleika er upplýsingainnihald blaðsértæks umbrotsefnisprófíls sundurliðað og það kemur í ljós að neysla jurtaæta getur virkjað sértæk efnaskipti. Óvænt komumst við að því, eins og lýst er í upplýsingakenningunni sem notuð var, að efnaskiptaástandið sem myndaðist hefur mikla skörun eftir árásir tveggja jurtaæta (næturfóðraða almenningsplöntunnar Sl) og Solanaceae sérfræðingsins Ms. Þó að fæðuhegðun þeirra og styrkur séu marktækt ólík. Fitusýru-amínósýru samtenging (FAC) frumkvöðull í OS (31). Með því að nota jurtaætu OS til að meðhöndla stöðluð stungusár, sýndi hermd meðferð jurtaæta einnig svipaða þróun. Þessi stöðluðu aðferð til að herma eftir viðbrögðum plantna við árásum jurtaæta útrýmir ruglingsþáttum sem orsakast af breytingum á fæðuhegðun jurtaæta, sem leiða til mismunandi skaða á mismunandi tímum (34). FAC, sem er þekkt fyrir að vera aðal orsök OSM, dregur úr JAS og öðrum plöntuhormónaviðbrögðum í OSS1, en OSS1 minnkar hundruðfalt (31). Hins vegar olli OSS1 svipuðum stigum JA uppsöfnunar samanborið við OSM. Áður hefur verið sýnt fram á að svörun JA í veikluðum Nepenthes er mjög næm fyrir OSM, þar sem FAC getur viðhaldið virkni sinni jafnvel þótt hún sé þynnt 1:1000 með vatni (44). Þess vegna, samanborið við OSM, þótt FAC í OSS1 sé mjög lágt, er það nægilegt til að valda nægilegri JA útbreiðslu. Fyrri rannsóknir hafa sýnt að hægt er að nota porín-lík prótein (45) og oligosakkaríð (46) sem sameindavísbendingar til að virkja varnarviðbrögð plantna í OSS1. Hins vegar er enn óljóst hvort þessir örvar í OSS1 bera ábyrgð á uppsöfnun JA sem sést í þessari rannsókn.
Þó fáar rannsóknir séu til sem lýsa mismunandi efnaskiptafingrafarförum af völdum notkunar mismunandi jurtaæta eða utanaðkomandi JA eða SA (salisýlsýru) (47), hefur enginn raskað tegundasértækri truflun á jurtaætukerfinu og áhrifum þess á sértækar persónuupplýsingar. Heildaráhrif efnaskipta eru kerfisbundið rannsökuð. Þessi greining staðfesti enn fremur að tengsl innra hormónanetsins við önnur plöntuhormón en JA mótar sértækni efnaskiptaendurskipulagningar af völdum jurtaæta. Sérstaklega greindum við að ET af völdum OSM var marktækt meiri en það sem OSS1 olli. Þessi háttur er í samræmi við meira FAC innihald í OSM, sem er nauðsynlegt og nægjanlegt skilyrði til að koma af stað ET springu (48). Í samhengi við samskipti plantna og jurtaæta er boðvirkni ET á plöntusértæka efnaskiptavirkni enn dreifð og beinist aðeins að einum efnasambandshópi. Auk þess hafa flestar rannsóknir notað utanaðkomandi notkun ET eða forvera þess eða ýmissa hemla til að rannsaka stjórnun ET, þar á meðal munu þessar utanaðkomandi efnafræðilegu notkunir valda mörgum ósértækum aukaverkunum. Okkur vitandi er þessi rannsókn fyrsta stórfellda kerfisbundna rannsóknin á hlutverki ET í notkun ET til að framleiða og skynja skerta erfðabreyttar plöntur til að samhæfa efnaskiptavirkni plantna. Sértæk ET örvun fyrir jurtaætur getur að lokum stjórnað efnaskiptaviðbrögðum. Mikilvægasta er erfðabreyting á ET lífmyndunargenum (ACO) og skynjunargenum (ETR1) sem leiddi í ljós nýja uppsöfnun fenólamíða fyrir jurtaætur. Áður hefur verið sýnt fram á að ET getur fínstillt JA-völdum nikótínuppsöfnun með því að stjórna pútresín N-metýltransferasa (49). Hins vegar, frá vélrænu sjónarmiði, er ekki ljóst hvernig ET fínstillir örvun fenamíðs. Auk merkjasendingarhlutverks ET er einnig hægt að beina efnaskiptaflæðinu að S-adenosýl-1-metíóníni til að stjórna fjárfestingu í pólýamínófenólamíðum. S-adenosýl-1-metíónín er ET og algengt milliefni í lífmyndunarferli pólýamína. Frekari rannsókna þarf á því hvernig ET merki stjórnar magni fenólamíðs.
Lengi vel, vegna mikils fjölda sérstakra umbrotsefna með óþekktri uppbyggingu, hefur mikil áhersla á tiltekna efnaskiptaflokka ekki getað metið nákvæmlega tímabundnar breytingar á efnaskiptafjölbreytni eftir líffræðilegar milliverkanir. Eins og er, byggt á greiningu upplýsingakenningar, er aðal niðurstaða MS/MS litrófsöflunar byggða á óhlutdrægum umbrotsefnum sú að jurtaætur sem éta eða herma eftir jurtaætum halda áfram að draga úr heildar efnaskiptafjölbreytni blaðaumbrotsefnisins en auka sérhæfingarstig þess. Þessi tímabundna aukning á sértækni umbrotsefna af völdum jurtaæta tengist samverkandi aukningu á sértækni umritunar. Það sem leggur mest af mörkum til þessarar stærri umbrotsefnasérhæfingar (með hærra Si gildi) er sérstakt umbrotsefni með áður skilgreindri jurtaætustarfsemi. Þetta líkan er í samræmi við spá OD kenningarinnar, en spáin um MT tengd handahófskenndri endurforritun umbrotsefna er ekki í samræmi. Hins vegar eru þessi gögn einnig í samræmi við spá blönduðu líkansins (besta MT; Mynd 1B), þar sem önnur óskilgreind umbrotsefni með óþekkt varnarstarfsemi geta samt fylgt handahófskenndri Si dreifingu.
Athyglisvert mynstur sem þessi rannsókn nær enn frekar er að frá örþróunarstigi (einstak planta og tóbaksstofn) til stærri þróunarstigs (náskyldar tóbakstegundir) eru mismunandi stig þróunarskipulagningar í „bestu vörninni“. Það er verulegur munur á hæfileikum jurtaæta. Moore o.fl. (20) og Kessler og Kalske (1) lögðu sjálfstætt til að umbreyta þremur virknistigum líffræðilegs fjölbreytileika sem Whittaker (50) upphaflega greindi frá í stöðugar og framkallaðar tímabundnar breytingar á efnafræðilegri fjölbreytileika; hvorki þessir höfundar gerðu samantekt á gögnunum. Aðferðirnar við stórfellda gagnasöfnun um efnaskipti lýsa heldur ekki hvernig á að reikna út efnaskiptafjölbreytileika út frá þessum gögnum. Í þessari rannsókn munu minniháttar breytingar á virkniflokkun Whittaker líta á α-efnaskiptafjölbreytileika sem fjölbreytileika MS/MS litrófs í tiltekinni plöntu og β-efnaskiptafjölbreytileika sem grunn innangreiningarefnaskipta hóps stofna. Rými og γ-efnaskiptafjölbreytileiki verður framlenging á greiningu á svipuðum tegundum.
JA merkið er nauðsynlegt fyrir fjölbreytt efnaskiptaviðbrögð jurtaæta. Hins vegar vantar nákvæmar megindlegar prófanir á framlagi innangreiningarstjórnunar á JA lífmyndun til fjölbreytileika efnaskipta, og hvort JA merkið sé almennur staður fyrir streituvaldandi efnaskiptafjölbreytni á hærri stórþróunarstigi er enn óljóst. Við komumst að því að jurtaæta Nepenthes veldur sérhæfingu efnaskipta og breytileiki í sérhæfingu efnaskipta innan stofns Nicotiana tegunda og meðal náskyldra Nicotiana tegunda er kerfisbundið jákvætt tengdur JA merkjum. Að auki, þegar JA merkið er skert, mun efnaskiptasértækni sem framkölluð er af einni erfðagerð jurtaætu hverfa (Mynd 3, C og E). Þar sem breytingar á efnaskiptarófi náttúrulega veiklaðra Nepenthes stofna eru að mestu megindlegar, gætu breytingarnar á efnaskipta β fjölbreytileika og sértækni í þessari greiningu að mestu leyti stafað af sterkri örvun efnaskiptaríkra efnasambanda. Þessir efnasambandaflokkar ráða ríkjum í hluta efnaskiptasniðsins og leiða til jákvæðrar fylgni við JA merki.
Vegna þess að lífefnafræðilegir ferlar tóbakstegundanna sem eru náskyldar henni eru mjög ólíkir, eru umbrotsefnin sérstaklega greind í eigindlegri þætti, þannig að það er greiningarlegra. Vinnsla upplýsingakenningarinnar á mældu efnaskiptaprófílinu leiðir í ljós að örvun jurtaætu eykur málamiðlunina milli fjölbreytni gamma í efnaskiptum og sérhæfingar. JA merkið gegnir lykilhlutverki í þessari málamiðlun. Aukning á sérhæfingu umbrotsefna er í samræmi við aðalspá um OD og er jákvætt tengd JA merkinu, en JA merkið er neikvætt tengd fjölbreytni gamma í efnaskiptum. Þessar gerðir benda til þess að OD getu plantna sé aðallega ákvörðuð af sveigjanleika JA, hvort sem er á örþróunarkvarða eða á stærri þróunarkvarða. Tilraunir með notkun utanaðkomandi JA sem komast hjá göllum í lífmyndun JA sýna enn fremur að náskyldar tóbakstegundir er hægt að greina í merkjasvörunar- og merkjaósvarandi tegundir, rétt eins og JA-aðferð þeirra og umbrotssveigjanleiki sem jurtaætur valda. Tegundir sem ekki svara merkjum geta ekki brugðist við vegna vanhæfni þeirra til að framleiða innrænt JA og eru því háðar lífeðlisfræðilegum takmörkunum. Þetta gæti stafað af stökkbreytingum í sumum lykilgenum í JA boðleiðinni (AOS og JAR4 í N. crescens). Þessi niðurstaða undirstrikar að þessi þróunarmynstur milli tegunda gætu aðallega verið knúin áfram af breytingum á innri hormónaskynjun og svörun.
Auk samspils plantna og jurtaæta tengist rannsóknir á efnaskiptafjölbreytileika öllum mikilvægum fræðilegum framförum í rannsóknum á líffræðilegri aðlögun að umhverfinu og þróun flókinna svipgerðareiginleika. Með aukinni gagnamagni sem nútíma MS mælitæki afla, geta tilgátuprófanir á efnaskiptafjölbreytileika nú farið fram úr mismun á einstaklingsbundnum/flokka efnaskiptaferlum og framkvæmt alþjóðlegar greiningar til að leiða í ljós óvænt mynstur. Í stórfelldri greiningu er mikilvæg myndlíking hugmyndin um að búa til marktæk kort sem hægt er að nota til að skoða gögn. Þess vegna er mikilvæg niðurstaða núverandi samsetningar óhlutdrægrar MS/MS efnaskiptafræði og upplýsingakenningar sú að hún veitir einfalda mælikvarða sem hægt er að nota til að smíða kort til að skoða efnaskiptafjölbreytileika á mismunandi flokkunarkvarða. Þetta er grunnkrafa þessarar aðferðar. Rannsóknir á ör-/makróþróun og vistfræði samfélaga.
Á stórþróunarstigi er kjarninn í kenningu Ehrlich og Raven (51) um samþróun plantna og skordýra að spá fyrir um að breytileiki í efnaskiptafjölbreytni milli tegunda sé orsök fjölbreytni plantnaætta. Hins vegar hefur þessi tilgáta sjaldan verið prófuð á þeim fimmtíu árum sem liðin eru frá útgáfu þessa byltingarkennda verks (52). Þetta er að miklu leyti vegna ættfræðilegra einkenna sambærilegra efnaskiptaeiginleika yfir langar plöntuættir. Sjaldgæfnin getur verið notuð til að festa markmiðsgreiningaraðferðir. Núverandi MS/MS vinnuflæði, sem unnið er með upplýsingakenningu, magngreinir MS/MS byggingarlíkindi óþekktra umbrotsefna (án fyrri vals á umbrotsefnum) og breytir þessum MS/MS í safn af MS/MS, þannig að í faglegum efnaskiptum eru þessi stórþróunarlíkön borin saman á flokkunarkvarða. Einfaldar tölfræðilegar vísbendingar. Ferlið er svipað og ættfræðileg greining, sem getur notað röðun til að magngreina hraða fjölbreytni eða þróunar persónuleika án þess að spá fyrir um það fyrirfram.
Á lífefnafræðilegu stigi sýnir skimunartilgáta Firns og Jones (53) að efnaskiptafjölbreytni er viðhaldið á mismunandi stigum til að veita hráefni til að beita líffræðilegri virkni áður óskyldra eða skiptna umbrotsefna. Aðferðir upplýsingakenningarinnar veita ramma þar sem hægt er að magngreina þessar umbrotsefnasértæku þróunarbreytingar sem eiga sér stað við sérhæfingu umbrotsefna sem hluta af fyrirhugaðri þróunarskimunarferli: líffræðilega virk aðlögun frá lágri sértækni til mikillar sértækni. Hömluð umbrotsefni í tilteknu umhverfi.
Í stuttu máli voru mikilvægar kenningar um varnarkerfi plantna þróaðar á fyrstu dögum sameindalíffræðinnar og afleiðslu-tilgátustýrðar aðferðir eru almennt taldar vera eina leiðin til vísindalegra framfara. Þetta er að miklu leyti vegna tæknilegra takmarkana við að mæla allt efnaskiptaferlið. Þó að tilgátustýrðar aðferðir séu sérstaklega gagnlegar við að velja aðra orsakatengda ferla, er geta þeirra til að auka skilning okkar á lífefnafræðilegum netum takmarkaðri en þær reikniaðferðir sem nú eru tiltækar í nútíma gagnafrekum vísindum. Þess vegna eru kenningar sem ekki er hægt að spá fyrir um langt utan gildissviðs tiltækra gagna, þannig að ekki er hægt að afnema tilgátuformúluna/prófunarhringrás framfara á rannsóknarsviðinu (4). Við sjáum fyrir okkur að reiknivinnuflæðið í efnaskiptafræði sem hér er kynnt geti endurvakið áhuga á nýlegum (hvernig) og loka (hvers vegna) málum um efnaskiptafjölbreytni og stuðlað að nýrri tíma fræðilega stýrðrar gagnavísinda. Tímabilið endurskoðaði mikilvægar kenningar sem innblástur fyrri kynslóða.
Bein fóðrun jurtaæta er framkvæmd með því að ala upp lirfur í öðru stigi eða Sl-lirfur á einu föllitu blaði af einni rósaplöntu, með 10 afritum af hverri plöntu. Skordýralirfurnar voru klemmdar með klemmum og afganginum af laufvef safnað 24 og 72 klukkustundum eftir smit og fryst, og umbrotsefnin voru dregin út.
Líkið eftir meðferð jurtaætu á mjög samstilltan hátt. Aðferðin felst í því að nota vefnaðarmynsturshjól til að stinga þrjár raðir af þyrnum hvoru megin við miðrif þriggja fullþróaðra laufblaða plöntunnar á vaxtarstigi vefnaðarkransins og bera strax á 1:5 þynnta Ms. Eða notið hanskaða fingur til að setja S1 OS í stungusárið. Uppskera og vinna lauf eins og lýst er hér að ofan. Notið aðferðina sem áður hefur verið lýst til að vinna út frumumbrotsefni og plöntuhormón (54).
Fyrir utanaðkomandi JA notkun eru þrjú blaðstilkar hverrar af sex rósaplöntum af hverri tegund meðhöndluð með 20 μl af lanólínmauki sem inniheldur 150 μg af MeJA (Lan + MeJA) og 20 μl af lanólíni ásamt sármeðferð (Lan + W), eða 20 μl af hreinu lanólíni eru notuð sem samanburðarpróf. Blöðin voru tínd 72 klukkustundum eftir meðhöndlun, fryst í fljótandi köfnunarefni og geymd við -80°C þar til þau voru notuð.
Fjórar erfðabreyttar JA og ET línur, þ.e. irAOC (36), irCOI1 (55), irACO og sETR1 (48), hafa fundist í rannsóknarhópi okkar. irAOC sýndi sterka lækkun á JA og JA-Ile gildum, en irCOI1 var ekki næmt fyrir JA. Samanborið við EV jókst uppsöfnun JA-Ile. Á sama hátt mun irACO draga úr framleiðslu ET, og samanborið við EV mun sETR1, sem er ónæmt fyrir ET, auka framleiðslu ET.
Ljóshljóðfræðilegur leysigeislamælir (Sensor Sense ETD-300 rauntíma ET skynjari) er notaður til að framkvæma ET mælingar án inngrips. Strax eftir meðhöndlun var helmingur laufanna skorinn og fluttur í 4 ml lokað glerflösku og loftrýmið látið safnast fyrir innan 5 klukkustunda. Meðan á mælingunni stóð var hvert flöskuflösku skolað með straumi upp á 2 lítra/klst af hreinu lofti í 8 mínútur, sem áður hafði farið í gegnum hvata frá Sensor Sense til að fjarlægja CO2 og vatn.
Gögnin úr örflögunum voru upphaflega birt í (35) og vistuð í gagnagrunni National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Comprehensive Database (aðgangsnúmer GSE30287). Gögnin sem samsvara laufblöðunum sem mynduðust við meðferð með W + OSMs og óskemmdum samanburðarhópi voru dregin út fyrir þessa rannsókn. Óunnin styrkleiki er log2. Fyrir tölfræðilega greiningu var grunngildið breytt og staðlað í 75. hundraðshlutann með því að nota R hugbúnaðarpakkann.
Upprunalegu RNA raðgreiningargögnin (RNA-seq) fyrir Nicotiana tegundina voru sótt úr NCBI Short Reading Archives (SRA), verkefnisnúmerið er PRJNA301787, sem Zhou o.fl. (39) birtu og framhaldið er eins og lýst er í (56). Óunnin gögn sem W + W, W + OSM og W + OSS1 unnu úr, sem samsvara Nicotiana tegundunum, voru valin til greiningar í þessari rannsókn og unnin á eftirfarandi hátt: Fyrst voru óunnin RNA-seq gögn breytt í FASTQ snið. HISAT2 breytir FASTQ í SAM og SAMtools breytir SAM skrám í flokkaðar BAM skrár. StringTie er notað til að reikna út genatjáningu og tjáningaraðferð þess er sú að það eru brot á hverja þúsund basabrot á hverja milljón raðgreindra umritunarbrota.
Acclaim litskiljunarsúlan (150 mm x 2,1 mm; agnastærð 2,2 μm) sem notuð var í greiningunni og 4 mm x 4 mm varnarsúlan eru úr sama efni. Eftirfarandi tvíundastigull er notaður í Dionex UltiMate 3000 Ultra High Performance Liquid Chromatography (UHPLC) kerfinu: 0 til 0,5 mínútur, ísókratískt 90% A [afjónað vatn, 0,1% (v/v) asetónítríl og 0,05% maurasýra], 10% B (asetónítríl og 0,05% maurasýra); 0,5 til 23,5 mínútur, stigullinn er 10% A og 90% B, talið í sömu röð; 23,5 til 25 mínútur, ísókratískt 10% A og 90% B. Flæðishraðinn er 400 μl/mín. Fyrir allar MS greiningar skal sprauta súluútskiljara í fjórpóla og flugtíma (qTOF) greiningartæki sem er búið rafúðagjafa sem starfar í jákvæðri jónunarham (háræðaspenna, 4500 V; háræðaúttak 130 V; þurrkhitastig 200°C; þurrkunarloftstreymi 10 lítrar/mín.).
Framkvæmið MS/MS brotagreiningu (hér eftir nefnd MS/MS) sem er óviðkomandi eða óaðgreinanleg frá gögnunum til að fá upplýsingar um heildar efnaskiptaferilinn sem hægt er að greina. Hugmyndin á bak við óaðgreinanlega MS/MS aðferð byggir á þeirri staðreynd að fjórpólinn hefur mjög stórt massaeinangrunarglugga [þess vegna skal líta á öll merki um massa-hleðsluhlutfall (m/z) sem brot]. Af þessari ástæðu, þar sem Impact II tækið gat ekki búið til CE-halla, voru nokkrar óháðar greiningar framkvæmdar með því að nota auknar árekstrarvaldandi sundrunarorku (CE) gildi. Í stuttu máli, fyrst skal greina sýnið með UHPLC-rafúðajónun/qTOF-MS með því að nota eina massagreiningarstillingu (lág sundrunarskilyrði mynduð af sundrun í upptökum), skanna frá m/z 50 til 1500 við endurtekningartíðni 5 Hz. Notið köfnunarefni sem árekstrargas fyrir MS/MS greiningu og framkvæmið óháðar mælingar við eftirfarandi fjórar mismunandi árekstrarvaldandi sundrunarspennur: 20, 30, 40 og 50 eV. Í öllu mælingarferlinu hefur fjórpólinn stærsta massaeinangrunargluggann, frá m/z 50 til 1500. Þegar m/z framhluta tilraunarinnar og einangrunarbreidd er stillt á 200, virkjast massabilið sjálfkrafa af stýrihugbúnaði tækisins og 0 Da. Skannið að massabrotum eins og í stakmassaham. Notið natríumformat (50 ml ísóprópanól, 200 μl maurasýru og 1 ml af 1M NaOH vatnslausn) til massakvarðunar. Með því að nota nákvæma kvörðunarreiknirit Bruker er gagnaskráin kvarðuð eftir að meðaltal litrófsins hefur verið keyrt á gefnu tímabili. Notið útflutningsaðgerðina í Data Analysis v4.0 hugbúnaðinum (Brook Dalton, Bremen, Þýskalandi) til að umbreyta hrágögnunum í NetCDF snið. MS/MS gagnasafnið hefur verið vistað í opna efnaskiptagagnagrunninum MetaboLights (www.ebi.ac.uk) með aðgangsnúmerinu MTBLS1471.
MS/MS samsetning er hægt að framkvæma með fylgnigreiningu milli MS1 og MS/MS gæðamerkja fyrir lága og háa árekstrarorku og nýlega innleiddar reglur. R forskriftin er notuð til að framkvæma fylgnigreiningu á dreifingu forvera afurðarinnar og C# forskriftin (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) er notuð til að útfæra reglurnar.
Til að draga úr fölskum jákvæðum villum af völdum bakgrunnshávaða og falskrar fylgni sem stafar af því að ákveðnir m/z eiginleikar greina í aðeins fáeinum sýnum, notum við „fylltan topp“ fallið í R pakkanum XCMS (til að leiðrétta bakgrunnshávaða). Ætti að nota það til að skipta út „NA“ (ógreindum toppi) styrkleika. Þegar fyllitoppsfallið er notað eru enn mörg „0“ styrkleikagildi í gagnasafninu sem munu hafa áhrif á fylgniútreikninginn. Síðan berum við saman niðurstöður gagnavinnslunnar sem fengust þegar fyllti toppfallið er notað og þegar fyllti toppfallið er ekki notað, og reiknum bakgrunnshávaðagildið út frá meðaltali leiðrétts áætlaðs gildis, og skiptum síðan þessum 0 styrkleikagildum út fyrir reiknað bakgrunnsgildi. Við skoðuðum einnig aðeins eiginleika þar sem styrkleiki fór yfir þrefalt bakgrunnsgildi og litum á þá sem „sanna toppa“. Fyrir PCC útreikninga eru aðeins m/z merki úr sýnisforvera (MS1) og brotagagnasettum með að minnsta kosti átta sönnum toppum tekin með í reikninginn.
Ef styrkleiki gæðaeinkennis forverans í öllu sýninu er marktækt í fylgni við minnkaða styrkleika sama gæðaeinkennis sem verður fyrir lágri eða mikilli árekstrarorku, og eiginleikinn er ekki merktur sem samsætutoppur af CAMERA, er hægt að skilgreina hann frekar. Síðan, með því að reikna út öll möguleg forvera-afurðarpör innan 3 sekúndna (áætlaður varðveislutími fyrir hámarksgeymslu), er fylgnigreining framkvæmd. Aðeins þegar m/z gildið er lægra en forveragildið og MS/MS sundrun á sér stað á sama stað sýnisins í gagnasafninu og forverinn sem hann er fenginn úr, telst hann brot.
Byggt á þessum tveimur einföldu reglum útilokum við tilgreind brot með m/z gildi sem eru hærri en m/z hins auðkennda forvera, og byggt á staðsetningu sýnisins þar sem forverinn birtist og tilgreinda brotinu. Einnig er mögulegt að velja gæðaeiginleika sem myndast af mörgum brotum í upprunanum sem mynduð eru í MS1 ham sem mögulega forvera, og þannig mynda umfram MS/MS efnasambönd. Til að draga úr þessari gagnaumframkvæmd, ef NDP líkindi litrófsins fara yfir 0,6, og þau tilheyra litrófinu „pcgroup“ sem CAMERA hefur skýrt, munum við sameina þau. Að lokum sameinum við allar fjórar CE niðurstöður sem tengjast forveranum og brotunum í loka afföllnu samsetta litrófið með því að velja hæsta styrkleikatoppinn meðal allra mögulegra tinda með sama m/z gildi við mismunandi árekstrarorku. Síðari vinnsluskref eru byggð á hugtakinu samsett litróf og taka tillit til mismunandi CE aðstæðna sem þarf til að hámarka líkur á sundrun, því sum brot er aðeins hægt að greina við tiltekna árekstrarorku.
RDPI (30) var notað til að reikna út örvunarhæfni efnaskiptaferilsins. Fjölbreytileiki efnaskiptarófsins (Hj vísitalan) er fenginn út frá magni MS/MS forvera með því að nota Shannon óreiðu MS/MS tíðnidreifingarinnar með því að nota eftirfarandi jöfnu sem lýst er af Martínez o.fl. (8). Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij) þar sem Pij samsvarar hlutfallslegri tíðni i-ta MS/MS í j-ta sýninu (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2, …, m) t).
Sértækni í efnaskiptum (Si vísitala) er skilgreind sem tjáningarsamsvörun tiltekins MS/MS í tengslum við tíðni milli sýnanna sem eru til skoðunar. Sértækni MS/MS er reiknuð sem Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)
Notið eftirfarandi formúlu til að mæla efnaskiptasértæka δj vísitölu hvers j sýnis og meðaltal MS/MS sértækni δj = ∑i = 1mPijSi
MS/MS litróf eru raðað saman í pörum og líkindin er reiknuð út frá stigunum tveimur. Fyrst, með því að nota hefðbundna NDP (einnig þekkt sem kósínusfylgniaðferð), skal nota eftirfarandi jöfnu til að meta líkindin milli litrófanna: NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2 þar sem S1 og S2. Á sama hátt, fyrir litróf 1 og litróf 2, sem og WS1, i og WS2, táknar i þyngdina miðað við tindstyrk þar sem mismunurinn á i-ta sameiginlega tindinum milli litrófanna tveggja er minni en 0,01 Da. Þyngdin er reiknuð út frá eftirfarandi: W = [tindstyrkur] m [gæði] n, m = 0,5, n = 2, eins og MassBank leggur til.
Önnur stigagjöfaraðferð var notuð, sem fól í sér að greina sameiginlegt NL milli MS/MS. Í þessu skyni notuðum við 52 NL lista sem oft koma fyrir í MS sundrunarferlinu saman, og sértækari NL (gagnaskrá S1) sem áður hefur verið skýrð fyrir MS/MS litróf auka umbrotsefna veiklaðrar Nepenthes tegundar (9, 26). Búið til tvíundavigur af 1 og 0 fyrir hverja MS/MS, sem samsvarar núverandi og ekki tilvist einhverra NL, talið í sömu röð. Byggt á fjarlægðarlíkindum Evklíðs er NL líkindastig reiknað fyrir hvert par af tvíunda NL vigrunum.
Til að framkvæma tvöfalda þyrpingu notuðum við R pakkann DiffCoEx, sem byggir á útvíkkun á Weighted Gene Co-expression Analysis (WGCNA). Með því að nota NDP og NL stigagjöfarfylki úr MS/MS litrófum notuðum við DiffCoEx til að reikna út samanburðarfylgnifylkið. Tvíundarþyrping er framkvæmd með því að stilla „cutreeDynamic“ breytuna á method = „hybrid“, cutHeight = 0.9999, deepSplit = T og minClusterSize = 10. R frumkóðinn fyrir DiffCoEx var sóttur úr viðbótarskrá 1 af Tesson o.fl. (57); Nauðsynlegan R WGCNA hugbúnaðarpakka er að finna á https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
Til að framkvæma MS/MS sameindanetgreiningu reiknuðum við paraða litrófstengingu byggða á NDP og NL líkindagerðum og notuðum Cytoscape hugbúnað til að sjá netkerfisuppbyggingu með því að nota lífræna uppsetningu í CyFilescape yFiles útlitsreiknirit viðbótinni.
Notið R útgáfu 3.0.1 til að framkvæma tölfræðilega greiningu á gögnunum. Tölfræðileg marktækni var metin með tvíhliða dreifingargreiningu (ANOVA), og síðan með Tukey's honestly marktækum mismunarprófi (HSD) eftir á. Til að greina muninn á jurtaætumeðferðinni og samanburðarhópnum var tvíhliða dreifing tveggja hópa sýna með sama dreifni greind með Student's t-prófi.
Sjá nánari upplýsingar um þessa grein á http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
Þessi grein er aðgengileg öllum samkvæmt skilmálum Creative Commons Attribution-Non-Commercial leyfisins, sem leyfir notkun, dreifingu og fjölföldun í hvaða miðli sem er, svo framarlega sem endanleg notkun er ekki í viðskiptalegum tilgangi og forsenda þess er að upprunalega verkið sé rétt. Heimild.
Athugið: Við biðjum þig aðeins um að gefa upp netfangið þitt svo að sá sem þú mælir með á síðunni viti að þú vilt að viðkomandi sjái tölvupóstinn og að hann sé ekki ruslpóstur. Við munum ekki safna neinum netföngum.
Þessi spurning er notuð til að kanna hvort þú sért gestur og koma í veg fyrir sjálfvirka ruslpóstsendingu.
Upplýsingakenningin veitir alhliða gjaldmiðil til að bera saman sérstök umbrotsefni og spá fyrir um kenningu um varnarpróf.
Upplýsingakenningin veitir alhliða gjaldmiðil til að bera saman sérstök umbrotsefni og spá fyrir um kenningu um varnarpróf.
©2021 American Association for the Advancement of Science. allur réttur áskilinn. AAAS er samstarfsaðili HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef og COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.