Við höfum áður greint frá því að sermisþéttni indól-3-própíónsýru (IPA), sem er umbrotsefni tryptófans sem kemur úr þörmum, er lægri hjá sjúklingum með lifrarfibrósu. Í þessari rannsókn rannsökuðum við umritun og DNA metýlóm í offitusjúkum lifrum í tengslum við IPA gildi í sermi, sem og hlutverk IPA í að örva svipgerðaróvirkjun á stjörnufrumum í lifur (HSCs) in vitro.
Rannsóknin náði til 116 offitusjúklinga án sykursýki af tegund 2 (T2DM) (aldur 46,8 ± 9,3 ára; líkamsþyngdarstuðull: 42,7 ± 5,0 kg/m²) sem gengust undir aðgerð vegna offitu á Kuopio offituskurðlækningamiðstöðinni (KOBS). IPA gildi í blóðrásinni voru mæld með vökvaskiljun-massagreiningu (LC-MS), greining á lifrarriti var framkvæmd með heildar RNA raðgreiningu og DNA metýlering greining var framkvæmd með Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Mannlegar stjarnafrumur úr lifur (LX-2) voru notaðar í in vitro tilraunum.
IPA-gildi í sermi tengdust tjáningu gena sem taka þátt í frumudauða, frumudauða og lifunarferlum í lifur. AKT serín/þreónín kínasa 1 (AKT1) genið var algengasta og ríkjandi samverkandi genið í lifrarritum og DNA metýleringarsniðum. IPA meðferð olli frumudauða, minnkaði öndun hvatbera og breytti frumugerð og hvatberadýnamík með því að stjórna tjáningu gena sem vitað er að stjórna bandvefsmyndun, frumudauða og lifun LX-2 frumna.
Samanlagt styðja þessi gögn að IPA hafi hugsanleg meðferðaráhrif og geti valdið frumudauða og fært HSC svipgerðina í óvirkt ástand, og þar með aukið möguleikann á að hamla lifrarfibrósu með því að trufla virkjun HSC og efnaskipti hvatbera.
Tíðni offitu og efnaskiptaheilkennis hefur verið tengd við vaxandi tíðni efnaskiptatengds fitusjúkdóms í lifur (MASLD); sjúkdómurinn hefur áhrif á 25% til 30% almennings [1]. Helsta afleiðing MASLD orsökarinnar er lifrarfibrósa, kraftmikið ferli sem einkennist af stöðugri uppsöfnun trefjakenndrar utanfrumuefnis (ECM) [2]. Helstu frumurnar sem taka þátt í lifrarfibrósu eru stjörnufrumur í lifur (HSCs), sem sýna fjórar þekktar gerðir: óvirkar, virkjaðar, óvirkjar og öldrunar [3, 4]. HSCs geta virkjast og aðgreinst úr óvirku formi í fjölgandi fibroblast-líkar frumur með mikla orkuþörf, með aukinni tjáningu á α-sléttvöðvaaktíni (α-SMA) og kollageni af gerð I (Col-I) [5, 6]. Við viðsnúning lifrarfibrósu eru virkjuð HSCs útrýmt með frumudauða eða óvirkjun. Þessi ferli fela í sér niðurstýringu á vefjamyndandi genum og stjórnun á lifunarstýrandi genum (eins og NF-κB og PI3K/Akt boðleiðum) [7, 8], sem og breytingar á virkni og virkni hvatbera [9].
Sermisþéttni tryptófan umbrotsefnisins indól-3-própíónsýru (IPA), sem framleitt er í þörmum, hefur reynst vera lækkuð í efnaskiptasjúkdómum hjá mönnum, þar á meðal MASLD [10–13]. IPA tengist neyslu fæðutrefja, er þekkt fyrir andoxunar- og bólgueyðandi áhrif sín og dregur úr fæðutengdri óáfengri fitubólgu í lifur (NASH) in vivo og in vitro [11–14]. Sumar vísbendingar koma frá fyrri rannsókn okkar, sem sýndi að sermisþéttni IPA var lægri hjá sjúklingum með lifrarfibrósu en hjá offitusjúklingum án lifrarfibrósu í Kuopio Bariatric Surgery Study (KOBS). Ennfremur sýndum við fram á að IPA meðferð gæti dregið úr tjáningu gena sem eru klassískir merki um frumuviðloðun, frumuflutning og virkjun blóðmyndandi stofnfrumna í líkani af lifrarstjörnufrumum manna (LX-2) og er hugsanlegt lifrarverndandi umbrotsefni [15]. Hins vegar er enn óljóst hvernig IPA veldur minnkun lifrarfibrósu með því að virkja HSC frumudauða og hvatbera líforku.
Hér sýnum við fram á að IPA í sermi tengist tjáningu gena sem eru auðguð í frumudauða, mítóáti og langlífisferlum í lifur offitusjúklinga sem ekki eru með sykursýki af tegund 2 (KOBS). Ennfremur komumst við að því að IPA getur örvað úthreinsun og niðurbrot virkjaðra blóðmyndandi stofnfrumna (HSCs) í gegnum óvirkjunarferlið. Þessar niðurstöður sýna nýtt hlutverk IPA, sem gerir það að hugsanlegu meðferðarmarkmiði til að stuðla að minnkun lifrarfibrósu.
Fyrri rannsókn í KOBS hópnum sýndi að sjúklingar með lifrarfibrósu höfðu lægri IPA gildi í blóðrásinni samanborið við sjúklinga án lifrarfibrósu [15]. Til að útiloka hugsanleg ruglingsleg áhrif sykursýki af tegund 2 fengum við 116 offitusjúklinga án sykursýki af tegund 2 (meðalaldur ± staðalfrávik: 46,8 ± 9,3 ár; líkamsþyngdarstuðull: 42,7 ± 5,0 kg/m2) (Tafla 1) úr KOBS rannsókninni sem er í gangi sem rannsóknarhóp [16]. Allir þátttakendur veittu skriflegt upplýst samþykki og rannsóknaráætlunin var samþykkt af siðanefnd Norður-Savo sýslusjúkrahússins í samræmi við yfirlýsingu Helsinki (54/2005, 104/2008 og 27/2010).
Sýni úr lifrarvefjasýnum voru tekin meðan á aðgerð stóð eftir offitu og reyndir meinafræðingar rannsökuðu þau vefjafræðilega samkvæmt áður lýstum viðmiðum [17, 18]. Matsviðmiðin eru tekin saman í viðbótartöflu S1 og hafa verið lýst áður [19].
Fastandi sermisýni voru greind með ómarkvissri vökvaskiljun-massagreiningu (LC-MS) fyrir efnaskiptagreiningu (n = 116). Sýnin voru greind með UHPLC-qTOF-MS kerfi (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Þýskalandi) eins og áður hefur verið lýst19. Auðkenning ísóprópýlalkóhóls (IPA) var byggð á varðveislutíma og samanburði á MS/MS litrófinu við hreina staðla. IPA merkisstyrkur (toppflatarmál) var tekinn til greina í öllum frekari greiningum [20].
Raðgreining á heilli RNA lifrar var framkvæmd með Illumina HiSeq 2500 og gögnum var forunnið eins og áður hefur verið lýst [19, 21, 22]. Við framkvæmdum markvissa mismunandi tjáningargreiningu á umritum sem hafa áhrif á starfsemi/lífmyndun hvatbera með því að nota 1957 gena sem valin voru úr MitoMiner 4.0 gagnagrunninum [23]. Metýlering DNA lifrar var framkvæmd með Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, Bandaríkin) með sömu aðferðafræði og áður hefur verið lýst [24, 25].
Mannlegar stjarnafrumur úr lifur (LX-2) voru vinsamlega gefnar af prófessor Stefano Romeo og voru ræktaðar og viðhaldið í DMEM/F12 miðli (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). Til að velja virkan skammt af IPA voru LX-2 frumur meðhöndlaðar með mismunandi styrk af IPA (10 μM, 100 μM og 1 mM; Sigma, 220027) í DMEM/F12 miðli í 24 klst. Ennfremur, til að kanna getu IPA til að óvirkja lifrarfrumur (HSCs), voru LX-2 frumur meðhöndlaðar samtímis með 5 ng/ml TGF-β1 (R&D systems, 240-B-002/CF) og 1 mM IPA í sermislausum miðli í 24 klst. Fyrir samsvarandi samanburðarhópa var 4 nM HCL sem innihélt 0,1% BSA notað fyrir TGF-β1 meðferð og 0,05% DMSO var notað fyrir IPA meðferð, og bæði voru notuð saman fyrir samsetta meðferðina.
Apoptósa var metin með FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit með 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, Bandaríkjunum, Cat# 640922) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Í stuttu máli voru LX-2 (1 × 105 frumur/hol) ræktaðar yfir nótt í 12 hols plötum og síðan meðhöndlaðar með mörgum skömmtum af IPA eða IPA og TGF-β1. Daginn eftir voru fljótandi og viðloðandi frumur safnaðar, trypsin-meðhöndlaðar, þvegnar með PBS, enduruppleystar í Annexin V bindingarlausn og ræktaðar með FITC-Annexin V og 7-AAD í 15 mínútur.
Hvatberar í lifandi frumum voru litaðir til að kanna oxunarvirkni með Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, Kaliforníu). Fyrir MTR prófanir voru LX-2 frumur litaðar í jöfnum þéttleika með IPA og TGF-β1. Eftir 24 klst. voru lifandi frumur trypsin-meðhöndlaðar, þvegnar með PBS og síðan litaðar með 100 μM MTR í sermislausu miðli við 37°C í 20 mínútur eins og áður hefur verið lýst [26]. Fyrir greiningu á formgerð lifandi frumna voru frumustærð og flækjustig umfrymis greind með því að nota framvirka dreifingu (FSC) og hliðardreifingu (SSC) breytur, talið í sömu röð.
Öll gögn (30.000 atvik) voru aflað með NovoCyte Quanteon (Agilent) og greind með NovoExpress® 1.4.1 eða FlowJo V.10 hugbúnaði.
Súrefnisnotkunarhraði (OCR) og utanfrumusýrun (ECAR) voru mæld í rauntíma með Seahorse utanfrumuflæðisgreiningartæki (Agilent Technologies, Santa Clara, Kaliforníu) útbúið með Seahorse XF Cell Mito Stress samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Í stuttu máli voru 2 × 104 LX-2 frumur/brunn sáð á XF96 frumuræktunarplötur. Eftir ræktun yfir nótt voru frumurnar meðhöndlaðar með ísóprópanóli (IPA) og TGF-β1 (viðbótaraðferðir 1). Gagnagreining var framkvæmd með Seahorse XF Wave hugbúnaði, sem inniheldur Seahorse XF Cell Energy Phenotype Test Report Generator. Út frá þessu var líforkuheilsuvísitala (BHI) reiknað út [27].
Heildar-RNA var umritað í cDNA. Sjá nánari aðferðir í heimild [15]. Mannlegt 60S ríbósómsýruprótein P0 (RPLP0) og cyclophilin A1 (PPIA) mRNA gildi voru notuð sem stöðug genviðmið. QuantStudio 6 pro rauntíma PCR kerfið (Thermo Fisher, Landsmeer, Hollandi) var notað með TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) eða Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050) og hlutfallsleg genatjáningarföldun var reiknuð með því að nota samanburðar Ct gildi hringrásarbreytur (ΔΔCt) og ∆∆Ct aðferðina. Nánari upplýsingar um forsendurnar eru í viðbótartöflum S2 og S3.
Kjarna DNA (ncDNA) og hvatbera DNA (mtDNA) voru einangruð með DNeasy blóð- og vefjasetti (Qiagen) eins og áður hefur verið lýst [28]. Hlutfallslegt magn mtDNA var reiknað með því að reikna út hlutfall hvers mark-mtDNA svæðis og rúmfræðilegs meðaltals þriggja kjarna DNA svæða (mtDNA/ncDNA), eins og lýst er í viðbótaraðferðum 2. Nánari upplýsingar um forsendur mtDNA og ncDNA eru í viðbótartöflu S4.
Lifandi frumur voru litaðar með Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, Kaliforníu) til að sjá fyrir sér millifrumu- og innanfrumunet hvatbera. LX-2 frumur (1 × 104 frumur/brunn) voru ræktaðar á glerröndum í samsvarandi ræktunarplötum með glerbotni (Ibidi GmbH, Martinsried, Þýskalandi). Eftir 24 klst. voru lifandi LX-2 frumur ræktaðar með 100 μM MTR í 20 mínútur við 37°C og frumukjarnarnir litaðir með DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) eins og áður hefur verið lýst [29]. Hvatberanet voru sjáanleg með Zeiss Axio Observer öfugum smásjá (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Þýskalandi) búinn Zeiss LSM 800 confocal einingu við 37°C í rakaðri andrúmslofti með 5% CO2 með 63×NA 1.3 hlutgleri. Við fengum tíu Z-seríu myndir fyrir hverja sýnishornstegund. Hver Z-röð inniheldur 30 hluta, hver með þykkt upp á 9,86 μm. Fyrir hvert sýni voru myndir af tíu mismunandi sjónsviðum teknar með ZEN 2009 hugbúnaði (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Þýskalandi) og greining á formgerð hvatbera var framkvæmd með ImageJ hugbúnaði (v1.54d) [30, 31] samkvæmt færibreytunum sem tilgreindar eru í viðbótaraðferðum 3.
Frumurnar voru festar með 2% glútaraldehýði í 0,1 M fosfatlausn, síðan festar með 1% osmíumtetroxíðlausn (Sigma Aldrich, MO, Bandaríkjunum), smám saman þurrkuð með asetoni (Merck, Darmstadt, Þýskalandi) og að lokum felld inn í epoxy plastefni. Mjög þunnar sneiðar voru útbúnar og litaðar með 1% úranýlasetati (Merck, Darmstadt, Þýskalandi) og 1% blýsítrati (Merck, Darmstadt, Þýskalandi). Mjög þunnar myndir voru teknar með JEM 2100F EXII rafeindasmásjá (JEOL Ltd, Tókýó, Japan) við 80 kV hröðunarspennu.
Lögun LX-2 frumna sem meðhöndlaðar voru með IPA í 24 klst. var greind með fasa-andstæðu smásjá við 50-falda stækkun með því að nota öfugan ljóssmásjá frá Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 og AxioCam MRm, Jena, Þýskalandi).
Klínísk gögn voru gefin upp sem meðaltal ± staðalfrávik eða miðgildi (millifjórðungsbil: IQR). Einhliða dreifigreining (samfelldar breytur) eða χ² próf (flokkabreytur) var notuð til að bera saman muninn á milli rannsóknarhópanna þriggja. Falskt jákvæð hlutfall (FDR) var notað til að leiðrétta fyrir endurteknar prófanir og gen með FDR < 0,05 voru talin tölfræðilega marktæk. Spearman fylgnigreining var notuð til að tengja CpG DNA metýleringu við IPA merkisstyrk, þar sem nafngildi p (p < 0,05) voru tilkynnt.
Ferilsgreining var framkvæmd með vefbundnu genagreiningartóli (WebGestalt) fyrir 268 umrit (nafngildi p < 0,01), 119 umrit tengd hvatberum (nafngildi p < 0,05) og 4350 CpG af 3093 lifrarumritum sem tengdust IPA gildum í sermi. Venny DB tólið (útgáfa 2.1.0), sem er fáanlegt án endurgjalds, var notað til að finna gen sem skarast og StringDB (útgáfa 11.5) var notað til að sjá prótein-prótein víxlverkun.
Fyrir LX-2 tilraunina voru sýni prófuð til að ganga úr skugga um eðlilegleika með D'Agostino-Pearson prófinu. Gögnum var fengin úr að minnsta kosti þremur líffræðilegum endurteknum prófum og þau sett í einstefnu ANOVA með Bonferroni post hoc prófi. P-gildi undir 0,05 var talið tölfræðilega marktækt. Gögn eru kynnt sem meðaltal ± staðalfrávik og fjöldi tilrauna er tilgreindur á hverri mynd. Allar greiningar og gröf voru framkvæmd með tölfræðihugbúnaðinum GraphPad Prism 8 fyrir Windows (GraphPad Software Inc., útgáfa 8.4.3, San Diego, Bandaríkin).
Fyrst rannsökuðum við tengsl IPA-gilda í sermi við umrit í lifur, líkama og hvatberum. Í heildarumritssniði var sterkasta genið sem tengdist IPA-gildum í sermi MAPKAPK3 (FDR = 0,0077; mítógen-virkjað prótein kínasa-virkjað prótein kínasa 3); í umritssniði sem tengdist hvatberum var sterkasta genið sem tengdist AKT1 (FDR = 0,7621; AKT serín/þreónín kínasa 1) (Viðbótarskrá 1 og Viðbótarskrá 2).
Við greindum síðan alþjóðleg umrit (n = 268; p < 0,01) og umrit tengd hvatberum (n = 119; p < 0,05) og komumst að því að stýrður frumudauði (apoptosis) var mikilvægasta leiðarkerfið (p = 0,0089). Fyrir umrit hvatbera sem tengdust IPA gildum í sermi einbeittum við okkur að stýrðum frumudauða (FDR = 0,00001), frumuáti (FDR = 0,00029) og TNF boðleiðum (FDR = 0,000006) (Mynd 1A, Tafla 2 og viðbótarmyndir 1A-B).
Greining á skörun á alþjóðlegum umritum tengdum hvatberum og DNA metýleringu í lifur manna í tengslum við IPA gildi í sermi. A táknar 268 alþjóðleg umrit, 119 umrit tengd hvatberum og DNA metýleruð umrit sem eru kortlögð á 3092 CpG staði sem tengjast IPA gildi í sermi (p gildi < 0,01 fyrir alþjóðleg umrit og DNA metýlerað, og p gildi < 0,05 fyrir hvatbera umrit). Helstu skörunar umritin eru sýnd í miðjunni (AKT1 og YKT6). B Samspilskort 13 gena með hæstu samspilsstig (0,900) við önnur gen var smíðað úr 56 skörunargenum (svartlínusvæði) sem tengdust marktækt IPA gildi í sermi með því að nota nettólið StringDB. Grænt: Gen kortlögð á frumuþátt genafrumfræðinnar (GO): hvatbera (GO:0005739). AKT1 er próteinið með hæstu einkunn (0,900) fyrir samskipti við önnur prótein byggt á gögnunum (byggt á textanámi, tilraunum, gagnagrunnum og samhliða tjáningu). Nethnútar tákna prótein og brúnir tákna tengingar milli próteina.
Þar sem umbrotsefni í þarmaflórunni geta stjórnað erfðafræðilegri samsetningu með DNA-metýleringu [32], rannsökuðum við hvort IPA-gildi í sermi tengdust DNA-metýleringu í lifur. Við komumst að því að tveir helstu metýleringsstaðirnir sem tengdust IPA-gildum í sermi voru nálægt prólín-serín-ríku svæði 3 (C19orf55) og hitasjokkprótein fjölskyldu B (lítill) meðlimur 6 (HSPB6) (viðbótarskrá 3). DNA-metýlering 4350 CpG (p < 0,01) tengdist IPA-gildum í sermi og var auðguð í langlífisstjórnunarferlum (p = 0,006) (Mynd 1A, Tafla 2 og Viðbótarmynd 1C).
Til að skilja líffræðilegu ferlana sem liggja að baki tengslunum milli IPA-gilda í sermi, alþjóðlegra umrita, umrita tengdra hvatbera og DNA-metýleringar í lifur manna, framkvæmdum við skörunargreiningu á genum sem greind voru í fyrri ferilsgreiningunni (Mynd 1A). Niðurstöður ferilsauðgunargreiningar á 56 skörunargenum (innan svarta línunnar á Mynd 1A) sýndu að frumudauðaferillinn (p = 0,00029) undirstrikaði tvö sameiginleg gen í þremur greiningunum: AKT1 og YKT6 (YKT6 v-SNARE hliðstæður), eins og sést á Venn-línunni (Viðbótarmynd 2 og Mynd 1A). Athyglisvert er að við komumst að því að AKT1 (cg19831386) og YKT6 (cg24161647) voru jákvætt tengd IPA-gildum í sermi (Viðbótarskrá 3). Til að bera kennsl á hugsanleg prótein-milliverkun milli genaafurða, völdum við 13 gen með hæsta sameiginlega svæðisstig (0,900) meðal 56 skörunargena sem inntak og smíðuðum milliverkunarkort. Samkvæmt öryggisstigi (jaðaröryggi) var AKT1 genið með hæstu einkunn (0,900) efst (Mynd 1B).
Byggt á ferilsgreiningunni komumst við að því að frumudauði var aðalferillinn, þannig að við könnuðum hvort IPA meðferð myndi hafa áhrif á frumudauða í stofnfrumum (HSCs) in vitro. Við höfum áður sýnt fram á að mismunandi skammtar af IPA (10 μM, 100 μM og 1 mM) voru ekki eitruð fyrir LX-2 frumur [15]. Þessi rannsókn sýndi að IPA meðferð við 10 μM og 100 μM jók fjölda lífvænlegra og drepfrumna. Hins vegar, samanborið við samanburðarhópinn, minnkaði frumulífvænleiki við 1 mM IPA styrk, en frumudrepshraði var óbreyttur (Mynd 2A, B). Næst, til að finna kjörstyrk til að örva frumudauða í LX-2 frumum, prófuðum við 10 μM, 100 μM og 1 mM IPA í 24 klst. (Mynd 2A-E og viðbótarmynd 3A-B). Athyglisvert er að IPA 10 μM og 100 μM drógu úr frumudauðahraða (%), en IPA 1 mM jók seint frumudauða og frumudauðahraða (%) samanborið við samanburðarhóp og var því valið fyrir frekari tilraunir (myndir 2A–D).
IPA veldur frumudauða í LX-2 frumum. Tvöföld litun með Annexin V og 7-AAD var notuð til að magngreina frumudauðahraða og frumugerð með flæðifrumusjá. BA frumur voru ræktaðar með 10 μM, 100 μM og 1 mM IPA í 24 klst. eða með F–H TGF-β1 (5 ng/ml) og 1 mM IPA í sermislausu miðli í 24 klst. A: lifandi frumur (Annexin V -/ 7AAD-); B: drepfrumur (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: snemmbærar (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: seinar (Annexin V+/7AAD.+); E, H: hlutfall af heildar snemmbærum og seint frumudauðafrumum í frumudauðahraða (%). Gögn eru gefin upp sem meðaltal ± staðalfrávik, n = 3 óháðar tilraunir. Tölfræðilegar samanburðir voru framkvæmdar með einstefnu ANOVA með Bonferroni post hoc prófi. *p < 0,05; ****p < 0,0001
Eins og við höfum áður sýnt fram á getur 5 ng/ml TGF-β1 örvað virkjun HSC með því að auka tjáningu klassískra merkjagena [15]. LX-2 frumur voru meðhöndlaðar með 5 ng/ml TGF-β1 og 1 mM IPA í samsetningu (Mynd 2E–H). TGF-β1 meðferð breytti ekki frumudauðahraða, en samhliða IPA meðferð jók seint frumudauða og frumudauðahraða (%) samanborið við TGF-β1 meðferð (Mynd 2E–H). Þessar niðurstöður benda til þess að 1 mM IPA geti stuðlað að frumudauða í LX-2 frumum óháð TGF-β1 örvun.
Við rannsökuðum frekar áhrif IPA á öndun hvatbera í LX-2 frumum. Niðurstöðurnar sýndu að 1 mM IPA minnkaði súrefnisnotkunarhraða (OCR) breytur: öndun utan hvatbera, grunn- og hámarksöndun, róteindaleka og ATP framleiðslu samanborið við samanburðarhópinn (Mynd 3A, B), en líforkuheilsuvísitalan (BHI) breyttist ekki.
IPA dregur úr öndun hvatbera í LX-2 frumum. Öndunarkúrfan fyrir hvatbera (OCR) er sýnd sem öndunarbreytur hvatbera (öndun utan hvatbera, grunnöndun, hámarksöndun, róteindaleki, ATP myndun, SRC og BHI). Frumur A og B voru ræktaðar með 10 μM, 100 μM og 1 mM IPA í 24 klst., talið í sömu röð. Frumur C og D voru ræktaðar með TGF-β1 (5 ng/ml) og 1 mM IPA í sermislausu miðli í 24 klst., talið í sömu röð. Allar mælingar voru staðlaðar miðað við DNA innihald með því að nota CyQuant búnaðinn. BHI: líforkuheilsuvísitala; SRC: öndunarforðageta; OCR: súrefnisnotkunarhraði. Gögn eru kynnt sem meðaltal ± staðalfrávik (SD), n = 5 óháðar tilraunir. Tölfræðilegar samanburðir voru framkvæmdar með einstefnu ANOVA og Bonferroni post hoc prófi. *p < 0,05; **p < 0,01; og ***p < 0,001
Til að fá ítarlegri skilning á áhrifum IPA á líforkufræðilegt snið LX-2 frumna sem virkjaðar voru með TGF-β1, greindum við oxunarfosfórun hvatbera með OCR (Mynd 3C, D). Niðurstöðurnar sýndu að meðferð með TGF-β1 gat dregið úr hámarksöndun, öndunarforðagetu (SRC) og BHI samanborið við samanburðarhópinn (Mynd 3C, D). Að auki minnkaði samsetta meðferðin grunnöndun, róteindaleka og ATP framleiðslu, en SRC og BHI voru marktækt hærri en hjá þeim sem fengu TGF-β1 (Mynd 3C, D).
Við framkvæmdum einnig „Cellular Energy Phenotype Test“ sem Seahorse hugbúnaðurinn býður upp á (viðbótarmynd 4A–D). Eins og sést á viðbótarmynd 3B, minnkaði bæði OCR og ECAR efnaskiptamöguleikar eftir TGF-β1 meðferð, en enginn munur sást á hópunum sem fengu samsetta meðferð og IPA meðferð samanborið við samanburðarhópinn. Ennfremur lækkuðu bæði grunn- og streitustig OCR eftir samsetta meðferð og IPA meðferð samanborið við samanburðarhópinn (viðbótarmynd 4C). Athyglisvert er að svipað mynstur sást með samsettri meðferð, þar sem engin breyting sást á grunn- og streitustigi ECAR samanborið við TGF-β1 meðferð (viðbótarmynd 4C). Í stofnfrumum með blóðfitu breytti minnkun á oxunarfosfórun hvatbera og geta samsettrar meðferðar til að endurheimta SCR og BHI eftir útsetningu fyrir TGF-β1 meðferð ekki efnaskiptamöguleikunum (OCR og ECAR). Samanlagt benda þessar niðurstöður til þess að IPA geti dregið úr líforku í stofnfrumum með blóðfitu, sem bendir til þess að IPA geti valdið lægri orkusniði sem færir stofnfrumu með blóðfitu í átt að óvirkjun (viðbótarmynd 4D).
Áhrif IPA á hvatberavirkni voru rannsökuð með þrívíddarmagngreiningu á hvatberalögunum og nettengingum sem og MTR litun (Mynd 4 og viðbótarmynd 5). Mynd 4 sýnir að, samanborið við samanburðarhópinn, minnkaði TGF-β1 meðferð meðalyfirborðsflatarmál, greinafjöldann, heildargreinalengdina og greinamótafjölda (Mynd 4A og B) og breytti hlutfalli hvatbera úr kúlulaga í meðallags formgerð (Mynd 4C). Aðeins IPA meðferð minnkaði meðalhvatberarúmmál og breytti hlutfalli hvatbera úr kúlulaga í meðallags formgerð samanborið við samanburðarhópinn (Mynd 4A). Aftur á móti hélst kúlulaga, meðalgreinalengd og hvatberavirkni, metin með MTR hvatberahimnuspennuháðu (Mynd 4A og E), óbreytt og þessir þættir voru ekki mismunandi milli hópa. Samanlagt benda þessar niðurstöður til þess að TGF-β1 og IPA meðferð virðist hafa áhrif á lögun og stærð hvatbera sem og flækjustig netsins í lifandi LX-2 frumum.
IPA breytir hvatberahreyfingum og magni hvatbera DNA í LX-2 frumum. A. Dæmigerðar confocal myndir af lifandi LX-2 frumum sem ræktaðar voru með TGF-β1 (5 ng/ml) og 1 mM IPA í 24 klst. í sermislausu miðli sem sýna hvatberanet lituð með Mitotracker™ Red CMXRos og kjarna litaða bláa með DAPI. Öll gögn innihéldu að minnsta kosti 15 myndir í hverjum hópi. Við fengum 10 Z-stafla myndir fyrir hverja sýnisgerð. Hver Z-ás röð innihélt 30 sneiðar, hver með þykkt 9,86 μm. Kvarðastika: 10 μm. B. Dæmigerðir hlutir (aðeins hvatberar) greindir með því að beita aðlögunarþröskuldi á myndina. Megindleg greining og samanburður á formfræðilegum nettengingum hvatbera var framkvæmd fyrir allar frumur í hverjum hópi. C. Tíðni hvatberaformahlutfalla. Gildi nálægt 0 gefa til kynna kúlulaga lögun og gildi nálægt 1 gefa til kynna þráðlaga lögun. D Hvatbera DNA (mtDNA) innihald var ákvarðað eins og lýst er í Efni og aðferðum. Greining á E Mitotracker™ Red CMXRos var framkvæmd með flæðifrumusjá (30.000 atburðir) eins og lýst er í Efniviður og Aðferðir. Gögn eru kynnt sem meðaltal ± staðalfrávik, n = 3 óháðar tilraunir. Tölfræðilegar samanburðir voru framkvæmdar með einhliða ANOVA og Bonferroni eftiráprófi. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Við greindum síðan mtDNA innihald í LX-2 frumum sem vísbendingu um fjölda hvatbera. Í samanburði við samanburðarhópinn var mtDNA innihaldið aukið í hópnum sem fékk TGF-β1 (mynd 4D). Í samanburði við hópinn sem fékk TGF-β1 var mtDNA innihaldið minna í hópnum sem fékk samsetta meðferð (mynd 4D), sem bendir til þess að IPA geti dregið úr mtDNA innihaldi og hugsanlega fjölda hvatbera sem og öndun hvatbera (mynd 3C). Ennfremur virtist IPA draga úr mtDNA innihaldi í samsettu meðferðinni en hafði ekki áhrif á MTR-miðlaða hvatberavirkni (myndir 4A–C).
Við rannsökuðum tengsl IPA við mRNA gildi gena sem tengjast bandvefsmyndun, frumudauða, lifun og hvatberastarfsemi í LX-2 frumum (Mynd 5A–D). Í samanburði við samanburðarhópinn sýndi hópurinn sem fékk TGF-β1 aukna tjáningu gena eins og kollagen tegund I α2 keðju (COL1A2), α-sléttvöðvaaktín (αSMA), matrix metalloproteinasa 2 (MMP2), vefjahemil metalloproteinasa 1 (TIMP1) og dynamin 1-líks genis (DRP1), sem bendir til aukinnar bandvefsmyndunar og virkjunar. Ennfremur, í samanburði við samanburðarhópinn, minnkaði TGF-β1 meðferð mRNA gildi kjarna pregnane X viðtaka (PXR), caspase 8 (CASP8), MAPKAPK3, hemil B-frumu α, örvunarefni kjarnaþáttar κ gensins ljós peptíðs (NFκB1A) og hemil kjarnaþáttar κB kínasa undireiningar β (IKBKB) (Mynd 5A–D). Í samanburði við TGF-β1 meðferð minnkaði samsett meðferð með TGF-β1 og IPA tjáningu COL1A2 og MMP2, en jók mRNA gildi PXR, TIMP1, B-frumu eitilæxli-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β og IKBKB. IPA meðferð minnkaði marktækt tjáningu MMP2, Bcl-2-tengds próteins X (BAX), AKT1, sjóntruflana próteins 1 (OPA1) og hvatbera samrunapróteins 2 (MFN2), en tjáning CASP8, NFκB1A, NFκB1B og IKBKB jókst samanborið við samanburðarhópinn. Hins vegar fannst enginn munur á tjáningu caspase-3 (CASP3), apoptotic peptidase activating factor 1 (APAF1), hvatbera samrunapróteins 1 (MFN1) og fission protein 1 (FIS1). Samanlagt benda þessar niðurstöður til þess að IPA-meðferð stýri tjáningu gena sem tengjast bandvefsmyndun, frumudauða, lifun og hvatberastarfsemi. Gögn okkar benda til þess að IPA-meðferð minnki bandvefsmyndun í LX-2 frumum; á sama tíma örvar hún lifun með því að færa svipgerðina í átt að óvirkjun.
IPA hefur áhrif á tjáningu fibroblast-, frumudauða-, lífvænleika- og hvatberadynamíkargena í LX-2 frumum. Súlurit sýna mRNA tjáningu miðað við innræna samanburðarhópinn (RPLP0 eða PPIA) eftir að LX-2 frumur voru örvaðar með TGF-β1 og IPA í sermislausu miðli í 24 klst. A gefur til kynna fibroblast-gen, B gefur til kynna frumudauða-frumur, C gefur til kynna lifandi frumur og D gefur til kynna hvatberadynamíkargenatjáningu. Gögn eru kynnt sem meðaltal ± staðalfrávik (SD), n = 3 óháðar tilraunir. Tölfræðilegar samanburðir voru framkvæmdar með einstefnu ANOVA og Bonferroni post hoc prófi. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Síðan voru breytingar á frumustærð (FSC-H) og flækjustigi umfrymis (SSC-H) metnar með flæðisfrumusjá (mynd 6A, B) og breytingar á frumugerð eftir IPA meðferð voru metnar með rafeindasmásjá (TEM) og fasaskilgreiningarsmásjá (viðbótarmynd 6A-B). Eins og búist var við jukust frumur í hópnum sem fékk TGF-β1 að stærð samanborið við samanburðarhópinn (mynd 6A, B), sem sýnir klassíska útþenslu grófs frymisnets (ER*) og áta (P), sem bendir til virkjunar blóðmyndandi stofnfrumna (HSC) (viðbótarmynd 6A). Hins vegar, samanborið við hópinn sem fékk TGF-β1, minnkaði frumustærð, flækjustig umfrymis (mynd 6A, B) og ER* innihald í hópnum sem fékk samsetta TGF-β1 og IPA (viðbótarmynd 6A). Ennfremur minnkaði IPA meðferð frumustærð, flækjustig umfrymis (myndir 6A, B), P og ER* innihald (viðbótarmynd 6A) samanborið við samanburðarhópinn. Að auki jókst magn stýrðra frumna eftir 24 klst. IPA meðferð samanborið við samanburðarhópinn (hvítar örvar, viðbótarmynd 6B). Samanlagt benda þessar niðurstöður til þess að 1 mM IPA geti örvað stýrðan stofnfrumudauða (HSC apoptosis) og snúið við breytingum á frumuformfræðilegum breytum sem TGF-β1 veldur, og þar með stjórnað frumustærð og flækjustigi, sem gæti tengst óvirkjun HSC.
IPA breytir frumustærð og flækjustigi umfrymis í LX-2 frumum. Dæmigerðar myndir af flæðisfrumugreiningu. Greiningin notaði frumulokunaraðferð sem er sértæk fyrir LX-2 frumur: SSC-A/FSC-A til að skilgreina frumuþýðið, FSC-H/FSC-A til að bera kennsl á tvífrumur og SSC-H/FSC-H fyrir frumustærðar- og flækjustigsgreiningu. Frumur voru ræktaðar með TGF-β1 (5 ng/ml) og 1 mM IPA í sermislausu miðli í 24 klst. LX-2 frumur voru dreifðar í neðri vinstri fjórðung (SSC-H-/FSC-H-), efri vinstri fjórðung (SSC-H+/FSC-H-), neðri hægri fjórðung (SSC-H-/FSC-H+) og efri hægri fjórðung (SSC-H+/FSC-H+) fyrir frumustærðar- og flækjustigsgreiningu umfrymis. B. Frumuformgerð var greind með flæðisfrumugreiningu með því að nota FSC-H (framdreifing, frumustærð) og SSC-H (hliðardreifing, flækjustig umfrymis) (30.000 atburðir). Gögnin eru kynnt sem meðaltal ± staðalfrávik, n = 3 óháðar tilraunir. Tölfræðilegar samanburðir voru framkvæmdar með einhliða ANOVA og Bonferroni eftir-hoc prófi. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 og ****p < 0,0001
Þarmaumbrotsefni eins og IPA hafa orðið vinsælt rannsóknarefni og bendir til þess að ný markmið gætu fundist í þarmaflórunni. Því er áhugavert að IPA, umbrotsefni sem við höfum tengt lifrarfibrósu í mönnum [15], hefur reynst vera mögulegt efnasamband gegn fibrosu í dýralíkönum [13, 14]. Hér sýnum við fram á í fyrsta skipti tengsl milli IPA í sermi og alþjóðlegrar lifrarumritunar og DNA metýleringar hjá offitusjúklingum án sykursýki af tegund 2 (T2D), sem undirstrikar frumudauða, frumuát og langlífi, sem og mögulegt gen sem gæti verið AKT1 og stjórnar lifrarjafnvægi. Önnur nýjung í rannsókn okkar er að við sýndum fram á samspil IPA meðferðar við frumudauða, frumugerð, hvatberalíforku og virkni í LX-2 frumum, sem bendir til lægra orkusviðs sem færir HSC svipgerðina í átt að óvirkjun, sem gerir IPA að mögulegum frambjóðanda til að bæta lifrarfibrósu.
Við komumst að því að frumudauði, mítófagi og langlífi voru mikilvægustu ferlarnir sem voru auðgaðir í lifrargenum sem tengjast IPA í blóðrás í sermi. Röskun á gæðastjórnunarkerfi hvatbera (MQC) getur leitt til truflunar á hvatberum, mítófagi og frumudauða, og þannig stuðlað að tilkomu MASLD [33, 34]. Því getum við velt því fyrir okkur að IPA gæti átt þátt í að viðhalda frumuvirkni og heilleika hvatbera í gegnum frumudauða, mítófagi og langlífi í lifur. Gögn okkar sýndu að tvö gen voru sameiginleg í þremur prófunum: YKT6 og AKT1. Það er vert að taka fram að YKT6 er SNARE prótein sem tekur þátt í samruna frumuhimnu. Það gegnir hlutverki í sjálfsáti og mítófagi með því að mynda upphafsfléttu með STX17 og SNAP29 á sjálfsátinu, og þannig stuðlað að samruna sjálfsátfrumna og lýsósóma [35]. Ennfremur leiðir tap á YKT6 virkni til skerts frumuáts [36], en uppstjórnun YKT6 tengist framgangi lifrarfrumukrabbameins (HCC), sem sýnir aukna frumulifun [37]. Á hinn bóginn er AKT1 mikilvægasta samverkandi genið og gegnir mikilvægu hlutverki í lifrarsjúkdómum, þar á meðal PI3K/AKT boðleiðinni, frumuhringrás, frumuflutningi, frumufjölgun, staðbundinni viðloðun, hvatberastarfsemi og kollagenseytingu [38–40]. Virkjað PI3K/AKT boðleið getur virkjað blóðmyndandi stofnfrumur (HSC), sem eru frumurnar sem bera ábyrgð á framleiðslu utanfrumuefnis (ECM), og truflun á stjórnun hennar getur stuðlað að tilkomu og framgangi lifrarvefsmyndunar [40]. Að auki er AKT einn af lykilþáttum frumulifunar sem hamlar p53-háðri frumudauða, og AKT virkjun gæti tengst hömlun á frumudauða í lifur [41, 42]. Niðurstöðurnar benda til þess að IPA gæti átt þátt í frumudauða tengdum hvatberum í lifur með því að hafa áhrif á ákvörðun lifrarfrumna um hvort þau fari í frumudauða eða lifi af. Þessi áhrif gætu verið stjórnuð af AKT og/eða YKT6 genum, sem eru mikilvæg fyrir lifrarjafnvægi.
Niðurstöður okkar sýndu að 1 mM IPA olli frumudauða og minnkaði öndun hvatbera í LX-2 frumum óháð TGF-β1 meðferð. Það er athyglisvert að frumudauði er aðalleið fyrir upplausn bandvefsmyndunar og virkjun blóðmyndandi stofnfrumna (HSC), og er einnig lykilatriði í afturkræfri lífeðlisfræðilegri svörun lifrarbandvefsmyndunar [4, 43]. Ennfremur veitti endurreisn BHI í LX-2 frumum eftir samsetta meðferð nýja innsýn í mögulegt hlutverk IPA í stjórnun líforku hvatbera. Við hvíldar- og óvirkar aðstæður nota blóðmyndandi frumur venjulega oxunarfosfórun hvatbera til að framleiða ATP og hafa litla efnaskiptavirkni. Hins vegar eykur HSC virkjun öndun og lífefnamyndun hvatbera til að bæta upp orkuþörf við að komast í glýkólýsuástand [44]. Sú staðreynd að IPA hafði ekki áhrif á efnaskiptagetu og ECAR bendir til þess að glýkólýsuferillinn sé minna forgangsraðaður. Á sama hátt sýndi önnur rannsókn að 1 mM IPA gat stjórnað öndunarkeðjuvirkni hvatbera í hjartavöðvafrumum, lifrarfrumulínu manna (Huh7) og æðaþelsfrumum í naflastreng manna (HUVEC); Hins vegar fundust engin áhrif IPA á glýkólýsu í hjartavöðvafrumum, sem bendir til þess að IPA geti haft áhrif á líforku annarra frumugerða [45]. Þess vegna gerum við ráð fyrir að 1 mM IPA geti virkað sem vægur efnafræðilegur aftengingarþáttur, þar sem það getur dregið verulega úr tjáningu bandvefsgena, frumugerð og líforku hvatbera án þess að breyta magni mtDNA [46]. Aftengingar hvatbera geta hamlað ræktunarvöldum bandvefsmyndun og HSC virkjun [47] og dregið úr ATP framleiðslu hvatbera sem er stjórnað eða örvuð af ákveðnum próteinum eins og aftengingarpróteinum (UCP) eða adenín núkleótíð translókasa (ANT). Þetta fyrirbæri getur verndað frumur gegn frumudauða og/eða stuðlað að frumudauða, allt eftir frumugerðinni [46]. Hins vegar er þörf á frekari rannsóknum til að skýra hlutverk IPA sem aftengingarþáttar hvatbera í óvirkjun blóðmyndandi stofnfrumna.
Við rannsökuðum síðan hvort breytingar á öndun hvatbera endurspeglast í formgerð hvatbera í lifandi LX-2 frumum. Athyglisvert er að meðferð með TGF-β1 breytir hlutfalli hvatbera úr kúlulaga í meðallag, með minnkaðri greiningu hvatbera og aukinni tjáningu DRP1, sem er lykilþáttur í klofnun hvatbera [48]. Ennfremur tengist sundrun hvatbera heildarflækjustigi netsins og umskipti frá samruna í klofnun eru mikilvæg fyrir virkjun blóðmyndandi stofnfrumna (HSC), en hömlun á klofnun hvatbera leiðir til frumudauða í HSC [49]. Þannig benda niðurstöður okkar til þess að meðferð með TGF-β1 geti valdið minnkun á flækjustigi hvatberanetsins með minnkaðri greiningu, sem er algengara í klofnun hvatbera sem tengist virkjuðum blóðmyndandi stofnfrumum (HSC). Ennfremur sýndu gögn okkar að IPA gæti breytt hlutfalli hvatbera úr kúlulaga í meðallag, og þar með dregið úr tjáningu OPA1 og MFN2. Rannsóknir hafa sýnt að niðurstýring OPA1 gæti valdið minnkun á möguleikum hvatberahimnu og kallað fram frumudauða [50]. MFN2 er þekkt fyrir að miðla samruna hvatbera og frumudauða [51]. Niðurstöðurnar benda til þess að örvun LX-2 frumna með TGF-β1 og/eða IPA virðist hafa áhrif á lögun og stærð hvatbera, sem og virkjunarástand og flækjustig netsins.
Niðurstöður okkar benda til þess að samsett meðferð með TGFβ-1 og IPA geti dregið úr mtDNA og frumugerð með því að stjórna mRNA tjáningu á bandvefsmyndun, frumudauða og lifunartengdum genum í frumum sem forðast frumudauða. IPA minnkaði reyndar mRNA tjáningarstig AKT1 og mikilvægra bandvefsmyndunargena eins og COL1A2 og MMP2, en jók tjáningarstig CASP8, sem tengist frumudauða. Niðurstöður okkar sýndu að eftir IPA meðferð minnkaði BAX tjáning og mRNA tjáning á TIMP1 fjölskyldueiningum, BCL-2 og NF-κB jókst, sem bendir til þess að IPA geti örvað lifunarmerki í blóðmyndandi stofnfrumum (HSCs) sem forðast frumudauða. Þessar sameindir geta virkað sem lifunarmerki í virkjuðum blóðmyndandi stofnfrumum, sem getur tengst aukinni tjáningu frumudauðahamlandi próteina (eins og Bcl-2), minnkaðri tjáningu frumudauðastýrandi BAX og flóknu samspili milli TIMP og NF-κB [5, 7]. IPA hefur áhrif sín í gegnum PXR og við komumst að því að samsett meðferð með TGF-β1 og IPA jók tjáningu PXR mRNA, sem bendir til bælingar á virkjun HSC. Virkjað PXR boðleiðir eru þekktar fyrir að hamla virkjun HSC bæði in vivo og in vitro [52, 53]. Niðurstöður okkar benda til þess að IPA geti tekið þátt í úthreinsun virkjaðra HSC með því að stuðla að frumudauða, draga úr bandvefsmyndun og efnaskiptum hvatbera og auka lifunarmerki, sem eru dæmigerð ferli sem breyta virkjuðu HSC svipgerð í óvirkjaða. Önnur möguleg skýring á hugsanlegum verkunarháttum og hlutverki IPA í frumudauða er að það hreinsar óvirka hvatbera fyrst og fremst í gegnum frumuát (innri leið) og ytri TNF boðleiðina (Tafla 1), sem er beint tengd NF-κB lifunarboðleiðinni (Viðbótarmynd 7). Áhugavert er að IPA-tengd auðguð gen geta örvað frumudauðastýrandi og lifunarstýrandi merki í frumudauðaleiðinni [54], sem bendir til þess að IPA geti örvað frumudauðaleiðina eða lifun með því að hafa samskipti við þessi gen. Hins vegar er enn óljóst hvernig IPA veldur frumudauða eða lifun við virkjun HSC og verkunarháttum þess.
IPA er örverufræðilegt umbrotsefni sem myndast úr tryptófani í fæðu í gegnum þarmaflóruna. Rannsóknir hafa sýnt að það hefur bólgueyðandi, andoxunareiginleika og erfðafræðilega stjórnandi eiginleika í þarmaumhverfinu.[55] Rannsóknir hafa sýnt að IPA getur haft áhrif á þarmastarfsemi og dregið úr oxunarálagi, sem getur stuðlað að staðbundnum lífeðlisfræðilegum áhrifum þess.[56] Reyndar er IPA flutt til marklíffæra í gegnum blóðrásina og þar sem IPA deilir svipaðri aðalumbrotsefnabyggingu með tryptófani, serótóníni og indólafleiðum, hefur IPA efnaskiptaáhrif sem leiða til samkeppnishæfra efnaskiptaferla.[52] IPA gæti keppt við tryptófanafleidd um bindistaði á ensímum eða viðtökum, sem hugsanlega raskar eðlilegum efnaskiptaferlum. Þetta undirstrikar þörfina fyrir frekari rannsóknir á lyfjahvörfum þess og lyfhrifum til að skilja meðferðargluggann betur.[57] Það á eftir að koma í ljós hvort þetta getur einnig gerst í blóðmyndandi stofnfrumum (HSCs).
Við viðurkennum að rannsókn okkar hefur nokkrar takmarkanir. Til að skoða sérstaklega tengsl tengd IPA útilokuðum við sjúklinga með sykursýki af tegund 2 (T2DM). Við viðurkennum að þetta takmarkar víðtæka notagildi niðurstaðna okkar fyrir sjúklinga með sykursýki af tegund 2 og langt genginn lifrarsjúkdóm. Þó að lífeðlisfræðileg styrkur IPA í sermi manna sé 1–10 μM [11, 20], var styrkur upp á 1 mM IPA valinn út frá hæsta eiturefnalausa styrk [15] og hæsta hlutfalli frumudauða, án þess að munur væri á hlutfalli drepfrumustofnsins. Þótt ofurlífeðlisfræðileg magn IPA hafi verið notað í þessari rannsókn, er engin samstaða um virkan skammt af IPA sem stendur [52]. Þó að niðurstöður okkar séu marktækar, þá er víðtækari efnaskiptaörlög IPA enn virkt rannsóknarsvið. Ennfremur fengust niðurstöður okkar um tengsl milli IPA-gilda í sermi og DNA-metýleringar lifrarrits ekki aðeins úr blóðmyndandi stofnfrumum heldur einnig úr lifrarvefjum. Við völdum að nota LX-2 frumur úr mönnum út frá fyrri niðurstöðum okkar úr umritunargreiningu um að IPA tengist virkjun blóðmyndandi stofnfrumna (HSC) [15] og að HSC eru helstu frumurnar sem taka þátt í framgangi lifrarvefsmyndunar. Lifrin er samsett úr mörgum frumugerðum, þannig að aðrar frumulíkön eins og samræktunarkerfi lifrarfrumna-HSC-ónæmisfrumna ásamt kaspasavirkjun og DNA sundrun, sem og verkunarháttum, þar á meðal próteinmagni, ættu að vera í huga til að rannsaka hlutverk IPA og samspil þess við aðrar frumugerðir í lifur.