Flokkun próteina í seytingarferlinu er nauðsynleg til að viðhalda hólfun frumna og jafnvægi. Auk skeljarmiðlaðrar flokkunar er hlutverk lípíða í kínesínflokkun í seytingarflutningsferlinu löng grundvallarspurning sem hefur ekki enn verið svarað. Hér framkvæmum við þrívíddar samtímis fjöllita háskerpu rauntímamyndgreiningu til að sanna in vivo að nýmynduð glýkósýlfosfatidýlinosítól-hreyfanleg prótein með mjög löngum keramíð lípíðeiningum eru klasað og flokkuð í sérhæfðan endoplasma netútgangsstað, sem er frábrugðinn þeim sem himnuprótein nota. Að auki sýnum við fram á að keðjulengd keramíðs í endoplasmic reticulum himnu er mikilvæg fyrir þessa flokkunarsértækni. Rannsókn okkar veitir fyrstu beinu in vivo sönnunargögnin til að flokka próteinfarm út frá lengd lípíðkeðju í sértæka útflutningsstaði í seytingarferlinu.
Í heilkjörnungafrumum eru próteinin sem myndast í endoplasmic reticulum (ER) síðan flokkuð við flutning í gegnum seytingarferilinn til afhendingar á viðeigandi frumuáfangastað (1). Auk hjúpsmiðlaðrar flokkunar hefur lengi verið talið að ákveðin lípíð geti einnig þjónað sem sértækir útgönguleiðir með því að flokka þau í ákveðin himnusvæði sem tilgreina prótein (2-5). Hins vegar skortir enn beinar in vivo sannanir til að sanna þennan mögulega lípíðtengda verkunarmáta. Til að leysa þetta grunnvandamál rannsökuðum við í geri hvernig glýkósýlfosfatidýlinositól (GPI) akkeruð prótein (GPI-AP) eru mismunandi flutt út frá ER. GPI-AP eru fjölbreytt úrval af lípíðtengdum frumuyfirborðspróteinum (6, 7). GPI-AP er seytt prótein sem er fest við ytri blöð frumuhimnunnar í gegnum glýkólípíðhlutann (GPI akkeri). Þau taka við GPI akkerum sem íhaldssamar breytingar eftir þýðingu í ER holrýminu (8). Eftir að GPI-AP hefur fest sig fer það í gegnum Golgi-kerfið (5, 9) frá ER að frumuhimnunni. Tilvist GPI-akkera veldur því að GPI-AP er flutt aðskilið frá himnubundnum próteinum (þar á meðal öðrum himnubundnum próteinum) eftir seytingarleiðinni (5, 9, 10). Í gerfrumum eru GPI-AP aðskilin frá öðrum seytuðum próteinum í frymisnetinu og síðan pakkað í einstakar blöðrur sem eru vafðar inn í hjúppróteinfléttu II (COPII) (6, 7). Ákvarðanir þessa flokkunarferlis í ER útflutningsferlinu eru óljósar, en það er talið að þessi aðferð gæti krafist lípíða, sérstaklega byggingarbreytinga á lípíðhluta GPI-akkerisins (5, 8). Í geri hefst lípíðbreyting GPI strax eftir að GPI festist og í mörgum tilfellum veldur það því að keramíð binst við 26 kolefna langkeðju mettaða fitusýru (C26:0) (11, 12). C26 keramíð er helsta keramíðið sem gerfrumur hafa framleitt hingað til. Það er myndað í ER og megnið af því er flutt út í Golgi-kerfið í gegnum COPII-blöðrur (13). Útflutningur GPI-AP úr ER krefst sérstaklega áframhaldandi keramíðmyndunar (14, 15) og umbreyting keramíðs í inositolfosfatkeramíð (IPC) í Golgi-kerfinu er háð GPI-akkerimyndun (16). Lífeðlisfræðilegar rannsóknir með gervihimnum hafa sýnt að mjög löng asýlkeðjukeramíð geta sameinast og myndað skipulögð svæði með einstökum eðlisfræðilegum eiginleikum (17, 18). Þessi gögn leiða til þeirrar tilgátu að C26 keramíð og GPI-AP með C26 keramíði noti eðlisfræðilega eiginleika sína til að sameinast í skipulögð svæði eða svæði í tiltölulega óreiðukenndu lipíðumhverfi ER-himnunnar. Það er aðallega samsett úr stuttum og ómettuðum glýserólípíðum (C16:1 og C18:1) (19, 20). Þessi svæði verða sérstaklega einbeitt að tilteknum útgangsstöðum ER (ERES), þar sem keramíð og keramíð-byggð GPI-AP geta verið flutt saman til Golgi í sömu sérstöku COPII blöðrunni (5).
Í þessari rannsókn höfum við prófað þennan fituefnatengda verkunarmáta beint með því að nota ofurupplausnar samfókala rauntíma myndgreiningarsmásjá (SCLIM), sem er háþróuð smásjártækni sem getur samtímis skoðað flúrljómandi merkt prótein. Þrívíddar- og þrívíddarmyndirnar (3D) hafa afar mikla upplausn og hraða í lifandi frumum (21, 22).
Við notuðum fyrst SCLIM tækni til að skilgreina frekar hvernig eðlilegt GPI-AP með C26 keramíðhópi var skimað úr himnuseytum próteinum eftir að hafa yfirgefið ER í S. cerevisiae. Til að kanna flokkun ER notuðum við erfðafræðilegt kerfi sem getur beint séð nýmyndaðan farm sem kemur inn í ERES in vivo (7, 23). Sem farm völdum við C26 keramíð-byggðan GPI-AP Gas1 merktan með grænu flúrljómandi próteini (GFP) og himnuseyttan prótein Mid2 merktan með nær-innrauða flúrljómandi próteini (iRFP), sem bæði miða á frumuhimnuna (24–26). Í sec31-1 hitanæma stökkbreytingunni eru þessir tveir farmar tjáðir undir galaktósa-örvandi hvata og stöðugum ERES merki. Við mikinn hita (37°C), vegna þess að sec31-1 stökkbreytingin hefur áhrif á virkni COPII hjúpsþáttar Sec31 til að hindra COPII spírun og ER útflutning, safnast nýmyndaður farmur upp í ER (23). Eftir kælingu niður í lágt hitastig (24°C) náðu sec31-1 stökkbreyttu frumurnar sér úr seytingarsvæðinu og uppsafnaður nýr tilbúinn farmur hófst að berast úr ER. CLIM sjónræn framsetning sýndi að megnið af nýmynduðu Gas1-GFP og Mid2-iRFP safnaðist enn fyrir í ER sec31-1 stökkbreyttu frumunum eftir ræktun við 37°C og síðan losun við 24°C í 5 mínútur (Mynd 1). Þar sem Mid2-iRFP er dreift um alla ER himnuna og Gas1-GFP er einbeitt og safnað á ósamfellda ER himnusvæðinu, er dreifing þeirra gjörólík (Mynd 1, A til C og Kvikmynd S1). Að auki, eins og sést á mynd 1D, hefur Gas1-GFP klasinn ekki Mid2-iRFP. Þessar niðurstöður benda til þess að GPI-AP og himnuprótein voru aðskilin snemma í mismunandi ER himnusvæði. Gas1-GFP klasinn er við hliðina á tilteknu ERES merktu með COPII hjúppróteini mCherry, Sec13 (mynd 1, E og F, og kvikmynd S1) (23).
sec31-1 frumur tjá galaktósa-framkallaða seytingu, langa asýlkeðju (C26) keramíð GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, grænt) og himnupróteinið Mid2-iRFP (TMP, blátt) og þessi uppbyggilega ERES merking Sec13-mCherry (ERES, magenta) var ræktuð við 37°C í 30 mínútur, færð í 24°C og mynduð með SCLIM 5 mínútum síðar. (A til C) sýnir dæmigerða sameinaða eða staka 2D mynd af plani (A), 2D vörpun af 10 z-sniðjum (B) eða 3D frumuhelmingamynd af farmi og ERES merkjum (C). Kvarðastika 1μm (A og B). Kvarðaeiningin er 0,551μm (C). Gas1-GFP greindist í aðskildum ER svæðum eða klasa, en Mid2-iRFP greindist og dreifðist um ER himnuna (C). (D) Grafið sýnir hlutfallslegan flúrljómunarstyrk Gas1-GFP og Mid2-iRFP í Gas1-GFP klasanum meðfram hvítu örvarlínunni (vinstri megin). AU, handahófskennd eining. (E og F) tákna þrívíddarmyndina sem sameinar vöruna og ERES merkið. Gas1-GFP klasar fundust nálægt tilteknu ERES. Kvarðaeiningin er 0,551 μm. (F) Hvíta, samfellda örin markar Gas1-GFP klasann sem tengist ERES. Miðju- og hægri spjöldin sýna sameinaða, stækkaða þrívíddarmynd og snúið yfirlit yfir valda Gas1-GFP klasa.
Náið rúmfræðilegt samband milli Gas1-GFP klasans og tiltekins ERES bendir til þess að Gas1-GFP geti komist inn í sértækt ERES, sem er frábrugðið þeirri sértækni sem Mid2-iRFP notar til að yfirgefa ER. Til að taka á þessum möguleika magngreindum við ERES hlutfallið fyrir aðeins eina eða tvær vörur (Mynd 2, A til C). Við komumst að því að flest ERES (70%) innihalda aðeins eina tegund af farmi. Neðri myndin á mynd 2C sýnir tvö dæmigerð dæmi um ERES með aðeins Gas1-GFP (Mynd 1) eða aðeins Mid2-iRFP (Mynd 2). Aftur á móti innihalda um það bil 20% af ERES tvo farma sem skarast á sama svæði. Kom í ljós að sumt ERES (10%) innihélt tvær gerðir af farmi, en þau voru einangruð á greinilega ólíkum svæðum. Þess vegna sýnir þessi tölfræðilega greining að eftir að ER er flutt út eru GPI-AP Gas1-GFP og himnufarmurinn Mid2-iRFP skipt í mismunandi ERES (Mynd 2D). Þessi flokkunarhagkvæmni er mjög í samræmi við fyrri lífefnafræðilega greiningu (6) og formfræðilega ákvörðun (7). Við getum einnig fylgst með hegðun sóttkvíarfarms sem fer inn í ERES (Mynd 2E og Kvikmynd S2). Mynd 2E sýnir að aðeins lítill hluti af Gas1-GFP (mynd 3) eða Mid2-iRFP (mynd 4) fer inn í ERES frá annarri hliðinni og er innilokaður á afmörkuðu svæði. Mynd 5 á mynd 2E sýnir að Gas1-GFP og Mid2-iRFP finnast stundum í sama ERES, en þau fara inn frá mismunandi hliðum og eru einbeitt á aðskildum svæðum sem geta táknað mismunandi COPII blöðrur. Við staðfestum einnig að aðskilnaðurinn og flokkunin sem sást á C26 keramíð-byggðu GPI-AP Gas1 sem sértæku ERES er sértæk vegna þess að annar himnu seytingarfarmur, GFP-merkta himnupróteinið Axl2 (27), sýnir svipaða hegðun og Mid2-iRFP. (Mynd S1 og Kvikmynd S3). Nýmyndað Axl2-GFP dreifist um himnuna í erfðamengisrásinni (ER) eins og Mid2-iRFP (mynd S1, A og B) og er staðsett með Mid2-iRFP í flestum ERES geislum (mynd S1, B til D). Myndir 1 og 2 á mynd 1. S1C sýna tvö dæmigerð dæmi um ERES þar sem tveir himnuflutningar skarast. Í þessum tilfellum fara báðir flutningarnir inn í ERES saman (mynd S1E, mynd 3 og kvikmynd S3).
Sec31-1 frumurnar sem tjá galaktósaörvandi seytingu, Gas1-GFP (GPI-AP, grænt) og Mid2-iRFP (TMP, blátt) og stöðug ERES merkt Sec13-mCherry (ERES, magenta) voru settar í 37°C. Eftir ræktun í 30 mínútur við °C, færðar í 24°C til að losa seytingarblokkann og myndir teknar með SCLIM eftir 20 mínútur. (A til C) Dæmigerðar 2D vörpunmyndir (A; kvarðastika, 1μm) eða 3D frumuhelmingamyndir (B og C; kvarðaeining, 0,456μm) af farminum og 10 z-snið merkt með ERES. Neðri spjaldið í (B) og spjaldið í (C) sýna unnar myndir til að sýna aðeins vörurnar sem eru til staðar í ERES (magenta) [Gas1-GFP (grátt) og Mid2-iRFP (ljósblátt)]. (C) Opin ör: ERES ber aðeins eitt farmstykki (1 til 4). Grár ör: ERES inniheldur aðgreindan farm (5). Hvítur, samfelldur ör: ERES inniheldur samstaðsettan farm. Hér að neðan: Valið stakt ERES inniheldur aðeins Gas1-GFP (1) eða Mid2-iRFP (2). Kvarðastika, 100 nm. (D) Magnbundin örmynd sem lýst er í (C). Meðalhlutfall ERES sem inniheldur aðeins einn farm (Gas1-GFP eða Mid2-iRFP), aðgreindan farm og skarast farm. Í þremur óháðum tilraunum, n = 432 í 54 reitum. Villustika = staðalfrávik. Tvíhliða óparað t-próf. *** P = 0,0002. (E) Þrívíddarmynd af völdum ERES af sóttkvíarfarmi merkt með (C). Gas1-GFP (grænt) (3) eða Mid2-iRFP (blátt) (4) fer inn í ERES (magenta) frá annarri hliðinni og er takmarkað við lítið svæði innan ERES. Stundum fara báðar gerðir farms inn í sama ERES (5) frá sömu hliðinni og eru takmarkaðar við einangrað svæði innan ERES. Kvarðastika, 100 nm.
Næst prófuðum við tilgátu um að langa asýlkeðju-ceramíðið (C26) sem er til staðar í ER-himnunni stýri sértækri þyrpingu og flokkun Gas1 í sértækt ERES. Í þessu skyni notuðum við breyttan gerstofn GhLag1, þar sem tveir innrænir keramíðsyntasar Lag1 og Lac1 voru skipt út fyrir GhLag1 (Lag1 hliðstæðu bómullar), sem leiddi til gerstofns með frumuhimnu sem er styttri en villta gerðin (Mynd 3A) (28). Massagreining (MS) sýndi að í villtum stofnum er 95% af heildarkeramíði mjög langt (C26) keramíð, en í GhLag1 er 85% af keramíði mjög langt (C18 og C16), aðeins 2% af keramíði er mjög langt (C26) keramíð. Þó að C18 og C16 keramíð séu helstu keramíðin sem hafa fundist í GhLag1 himnunni hingað til, staðfesti MS greining einnig að GPI akkerið í Gas1-GFP sem tjáð er í GhLag1 stofninum inniheldur C26 keramíð, sem er sambærilegt við villta gerð lípíða. Gæðin eru þau sömu (Mynd 3A) (26). Þetta þýðir því að keramíð endurgerðarensímið Cwh43 er mjög sértækt fyrir C26 keramíð, eins og sést á mynd 26, það felur helst í sér GPI akkerið úr litlu magni af C26 keramíði í GhLag1 stofninum. S2 (29). Engu að síður inniheldur frumuhimna GhLag1 í grundvallaratriðum aðeins C18-C16 keramíð, en Gas1-GFP inniheldur enn C26 keramíð. Þessi staðreynd gerir þennan stofn að kjörnu tæki til að leysa sérstaklega vandamálið með asýlkeðjulengd himnukeramíðs í ER. Tilgáta um hlutverk flokkunar og flokkunar. Síðan rannsökuðum við fyrst getu C26 Gas1-GFP til að safnast fyrir í klasa í GhLag1 með hitanæmri stökkbreytingu af sec31-1 með hefðbundinni flúrljómunarsmásjá, þar sem aðeins langa (C18-C16) keðjan er til staðar í ER himnunni Ceramide (Mynd 3). Við sáum að í sec31-1 var megnið af Gas1-GFP einbeitt í klasa, en Gas1-GFP í sec31-1 GhLag1 með langri (C18-C16) langri keramíð ER himnu var aðallega ekki klasað og dreift í allri ER himnunni. Nákvæmlega, þar sem C26 keramíð-byggð klasamyndun er nátengd sérstökum ERES (Mynd 1), rannsökuðum við næst hvort þetta ferli gæti einnig falið í sér virkni ER útflutningspróteinkerfisins. GPI-AP notar sérstakt COPII kerfi fyrir ER útflutning, sem er virkt stjórnað af byggingarbreytingum Ted1 á glýkanhluta GPI akkerisins (30, 31). Endurmyndaða GPI-glýkanið er síðan þekkt af himnubundnu farmviðtaka p24 fléttunni, sem aftur á móti dregur sértækt úr Lst1, sem er sértæk ísóform af aðal COPII farmbindandi undireiningunni Sec24, og myndar GPI-AP-ríka COPII. Blöðrur eru nauðsynlegar (31-33). Þess vegna smíðuðum við tvöfalda stökkbreytingu sem sameinaði eyðingu þessara stöku próteina (p24 fléttuþáttarins Emp24, GPI-glýkan endurgerðarensímsins Ted1 og sértæka COPII undireiningarinnar Lst1) við sec31-1 stökkbreytingarstofninn og rannsökuðum hvort það sé mögulegt að mynda Gas1-klasa GFP (Mynd 3). Við sáum að í sec31-1emp24Δ og sec31-1ted1Δ er Gas1-GFP aðallega óklastað og dreift um ER himnuna, eins og áður hefur sést í sec31-1 GhLag1, en í sec31-1lst1Δ er Gas1-GFP eins og sec31-1. Þessar niðurstöður benda til þess að auk nærveru C26 keramíðs í ER himnunni þurfi þyrping Gas1-GFP einnig að bindast p24 fléttunni og krefst ekki sérstakrar Lst1 ráðningar. Síðan könnuðum við möguleikann á því að keðjulengd keramíðs í ER himnunni geti stjórnað bindingu Gas1-GFP við p24. Hins vegar komumst við að því að nærvera C18-C16 keramíðs í himnunni hefur ekki áhrif á GPI-glýkana sem p24 fléttan endurskapar (myndir S3 og S4, A og B) eða bindingu við GPI-AP og útflutningsgetu GPI-AP. Ráðning COPII undirgerð Lst1 (mynd S4C). Þess vegna krefst C26 keramíðháð þyrping ekki próteinvíxlverkunar við mismunandi ER útflutningspróteinferli, heldur styður annan flokkunarferli sem er knúið áfram af lípíðlengd. Síðan greindum við hvort lengd keramíð asýlkeðjunnar í ER himnunni sé mikilvæg fyrir árangursríka flokkun Gas1-GFP sem sértækt ERES. Þar sem Gas1 í GhLag1 stofninum með stuttkeðju keramíð yfirgefur ER og fer inn í frumuhimnuna (Mynd S5), teljum við að ef flokkunin er knúin áfram af lengd keramíð asýlkeðjunnar, þá geti Gas1 í GhLag1 stofninum verið beint aftur og farið yfir hana. ERES vörur með sömu himnu.
(A) Frumuhimna GhLag1 inniheldur aðallega styttri C18-C16 keramíð, en GPI akkerið í Gas1-GFP hefur enn sama C26 IPC og villigerðarfrumur. Hér að ofan: Greining á asýlkeðjulengd keramíðs í frumuhimnu villigerðar (Wt) og GhLag1p stofna með massagreiningu (MS). Gögnin tákna hlutfall heildarkeramíðs. Meðaltal þriggja óháðra tilrauna. Villustika = SD. Tvíhliða óparað t-próf. **** P <0,0001. Neðri spjaldið: MS greining á asýlkeðjulengd IPC sem er til staðar í Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI akkerinu sem er tjáð í villigerðar- og GhLag1p stofnum. Gögnin tákna hlutfall heildar IPC merkis. Meðaltal fimm óháðra tilrauna. Villustika = SD. Tvíhliða óparað t-próf. ns, ekki mikilvægt. P = 0,9134. (B) Flúrljómunarsmásjármyndir af sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ og sec31-1lst1Δ frumum sem tjá galaktósa-örvað Gas1-GFP voru ræktaðar við 37°C í 30 mínútur og sendar niður í 24°C. Framkvæmið venjubundna flúrljómunarsmásjárskoðun eftir 24°C. Hvít ör: ER Gas1-GFP klasa. Opin ör: Óklasað Gas1-GFP er dreift um alla ER himnuna, sem sýnir einkennandi ER kjarnahringlitun. Kvarðastika, 5μm. (C) Magnbundin smásjármynd sem lýst er í (B). Meðalhlutfall frumna með punktalaga Gas1-GFP uppbyggingu. Í þremur óháðum tilraunum, n≥300 frumur. Villustika = SD. Tvíhliða óparað t próf. **** P <0,0001.
Til að leysa þetta vandamál beint framkvæmdum við SCLIM sjónræna framsetningu á Gas1-GFP og Mid2-iRFP í GhLag1 með sec31-1 hitanæmu stökkbreyttu erfðavísinum (Mynd 4 og Kvikmynd S4). Eftir að ER var geymt við 37°C og síðan losað við 24°C, var megnið af nýmyndaða Gas1-GFP ekki klasað og dreift um ER himnuna, eins og sést með hefðbundnum smásjám (Mynd 4, A og B). Að auki inniheldur stór hluti ERES (67%) tvær gerðir af farmi sem eru staðsettir saman í því (Mynd 4D). Spjöld 1 og 2 á Mynd 4C sýna tvö dæmigerð dæmi um ERES með skörun Gas1-GFP og Mid2-GFP. Að auki voru bæði efnin færð inn í sama ERES (Mynd 4E, spjald 3 og Kvikmynd S4). Þess vegna benda niðurstöður okkar til þess að lengd keramíð asýlkeðjunnar í ER himnunni sé mikilvægur ákvarðandi þáttur í samloðun og flokkun ER próteina.
Sec31-1 GhLag1 frumur sem tjá galaktósa-framkallaða seytingu, Gas1-GFP (GPI-AP, græn) og Mid2-iRFP (TMP, blá) og stöðug ERES-merkt Sec13-mCherry (ERES, magenta). Ræktið við 37°C. Haldið áfram í 30 mínútur, ljúkið við 24°C til að losa seytingu og takið mynd með SCLIM eftir 20 mínútur. (A til C) Dæmigerðar 2D vörpunarmyndir (A; kvarðastika, 1μm) eða 3D frumuhelmingamyndir (B og C; kvarðaeining, 0,45μm) af 10 z-sniðunum merktum með farmi og ERES. Neðri spjaldið í (B) og spjaldið í (C) sýna unnar myndir til að sýna aðeins þær vörur sem eru til staðar í ERES (magenta) [Gas1-GFP (grátt) og Mid2-iRFP (ljósblátt)]. (C) Hvítfyllt ör: ERES, vörur skarast. Opin ör: ERES inniheldur aðeins einn hlut. Neðri spjaldið: Valið ERES hefur skarastandi vörur (1 og 2) merktar í (C). Kvarðastika, 100 nm. (D) Magnbundin smásjármynd sem lýst er í (C). Í sec31-1 og sec31-1 GhLag1 einingunum er aðeins einn farmur (Gas1-GFP eða Mid2-iRFP) innifalinn, og meðalhlutfall ERES fyrir einangraðan farm og skarastandi farm. Í þremur óháðum tilraunum, n = 432 í 54 frumum (sec31-1) og n = 430 í 47 frumum (sec31-1 GhLag1). Villustika = staðalfrávik. Tvíhliða óparað t próf. *** P = 0,0002 (sec31-1) og ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Þrívíddarmynd af völdum ERES með skarastandi farmi (3) merkt í (C). Gas1-GFP (grænt) og Mid2-iRFP (blátt) nálgast ERES (magenta) frá sömu hlið og halda sig innan sama ERES-takmarkaða svæðisins. Kvarðastika, 100 nm.
Þessi rannsókn veitir beinar in vivo vísbendingar um að lípíðbundnir próteinfarmar eru flokkaðir í sértæka útflutningsstaði í seytingarferlinu og sýnir mikilvægi asýlkeðjulengdar fyrir flokkunarval. Með því að nota öfluga og nýjustu smásjártækni sem kallast SCLIM sýndum við fram á nýmyndað Gas1-GFP (mikilvægur GPI-AP í plasmahimnu með mjög löngum asýlkeðju (C26) keramíð lípíðhluta) í geri. Svæðin sem eru flokkuð í aðskildum ER eru tengd sérstökum ERES, en himnubundnar seytingarprótein eru dreifð um ER himnuna (Mynd 1). Að auki fara þessar tvær gerðir af vörum sértækt inn í mismunandi ERES (Mynd 2). Asýlkeðjulengd frumukeramíðsins í himnunni minnkar úr C26 í C18-C16, Gas1-GFP klasinn rofnar í aðskilda ER svæðið og Gas1-GFP er endurbeint til að yfirgefa ER með himnubundna próteininu í gegnum sama ERES (Mynd 3 og Mynd 3). 4).
Þó að GPI-AP noti sérhæfðan próteinkerfi til að fara úr ER, komumst við að því að C26 keramíðháð aðskilnaður byggir ekki á mismunandi próteinvíxlverkunum sem geta leitt til sérhæfingar í ERES (myndir S4 og S5). Þess í stað styðja niðurstöður okkar aðra flokkunarkerfi sem knúið er áfram af lípíðbundinni próteinþyrpingu og síðari útilokun annarra farma. Athuganir okkar benda til þess að Gas1-GFP svæðið eða þyrpingin sem tengist tilteknu ERES skortir himnubundna seytingu próteinsins Mid2-iRFP, sem bendir til þess að C26 keramíðháði GPI-AP þyrpingin muni auðvelda þeim að komast inn í viðkomandi ERES og á sama tíma útiloka himnubundna seytingu. Seytingarnar fara inn í þetta tiltekna ERES (myndir 1 og 2). Aftur á móti veldur nærvera C18-C16 keramíða í ER himnunni ekki því að GPI-AP myndar svæði eða klasa, þannig að þau útiloka ekki eða koma í stað himnubundna seytingar próteina í sama ERES (myndir 3 og 4). Þess vegna leggjum við til að C26 keramíð knýr aðskilnað og flokkun með því að auðvelda klasamyndun próteina sem tengjast tilteknum ERES.
Hvernig á að ná þessari C26 keramíðháðu þyrpingu í ákveðið ER svæði? Tilhneiging himnukeramíða til að aðskiljast lárétt getur valdið því að GPI-AP og C26 keramíð mynda lítil og samstundis skipulögð lípíð í óreglulegra lípíðumhverfi ER himnunnar sem inniheldur styttri og ómettuð glýserólípíð. Gæðaklasar (17, 18). Þessir litlu tímabundnu klasar geta síðan sameinast í stærri og stöðugri klasa eftir bindingu við p24 fléttuna (34). Í samræmi við þetta sýndum við fram á að C26 Gas1-GFP þarf að hafa samskipti við p24 fléttuna til að mynda stærri sýnilega klasa (Mynd 3). p24 fléttan er arfblendinn fjölliða sem samanstendur af fjórum mismunandi p24 himnutengdum próteinum í geri (35), sem veitir fjölgilda bindingu, sem getur leitt til þvertengingar lítilla GPI-AP klasa og þannig myndað stærri stöðugan klasa (34). Samspil prótein-ectodomains í GPI-APs gæti einnig stuðlað að samloðun þeirra, eins og sést við Golgi-flutning þeirra í skautuðum þekjufrumum spendýra (36). Hins vegar, þegar C18-C16 keramíð er til staðar í ER-himnunni, þegar p24-fléttan binst Gas1-GFP, myndast ekki stórir aðskildir klasar. Undirliggjandi verkunarháttur gæti verið háður sérstökum eðlis- og efnafræðilegum eiginleikum langrar asýlkeðjukeramíðs. Lífeðlisfræðilegar rannsóknir á gervihimnum sýna að þó að bæði langar (C24) og stuttar (C18-C16) asýlkeðjukeramíð geti valdið fasaaðskilnaði, geta aðeins langar asýlkeðjukeramíð (C24) stuðlað að mikilli sveigju og beygju filmu til að endurmóta filmuna. Með gagnkvæmri tilvísun (17, 37, 38). Það hefur verið sýnt fram á að himnuþvermál TMED2, sem er hliðstæður Emp24 í mönnum, hefur sértæk samskipti við C18 keramíð-byggða sfingómýelín í umfrymisblöðrum (39). Með því að nota sameindahreyfingarlíkön (MD) komumst við að því að bæði C18 og C26 keramíð safnast fyrir í kringum umfrymisblöðrur Emp24 himnuþvermálsins og þau hafa svipaða eiginleika (Mynd S6). Það er vert að taka fram að þetta bendir til þess að himnuþvermál Emp24 geti leitt til ósamhverfrar dreifingar lípíða í himnunni. Þetta er nýleg niðurstaða byggð á spendýrafrumum. Svipaðar MD líkön sýna einnig tilvist eterlípíða (40). Þess vegna gerum við ráð fyrir að C26 keramíð í tveimur blöðrum ER26 sé staðbundið auðgað. Þegar GPI-AP í blöðrum himnunnar binst beint við fjölgilda p24 og uppsöfnun C26 keramíðs í kringum p24 í blöðrum frumna, getur það stuðlað að próteinsamloðun og himnubjúg myndast í gegnum fingurna (41), sem veldur því að GPI-AP aðskilst í aðskilin svæði aðliggjandi ERES, sem einnig styður mjög sveigð svæði ER himnunnar (42). Fyrri skýrslur studdu þennan verkunarmáta (43, 44). Fjölgild binding oligolectina, sýkla eða mótefna við keramíð-byggð glýkósfingólípíð (GSL) á frumuhimnu veldur mikilli GSL samloðun, eykur fasaaðskilnað og veldur aflögun og innlimun himnunnar (44). Iwabuchi o.fl. (43) Kom í ljós að í návist langra (C24) en ekki stuttra (C16) asýlkeðja, olli fjölgildi bindillinn sem bundinn var við GSL laktósýlseramíð myndun stórra klasa og himnuinnrásar, og Lyn-miðlað merkjasending í umfrymi á smáblöðunum er fléttuð saman af asýlkeðjum í tengdum daufkyrningum.
Í skautuðum þekjufrumum spendýra stjórnar styrkur and-Golgi netsins (TGN) upp að yfirborði plasmahimnunnar aðskilnaði og flokkun GPI-AP (10, 45). Þessi samloðun er knúin áfram af GPI-AP fáliðun (36), en hún getur einnig verið háð lengd keramíðkeðjunnar sem við finnum í geri. Þó að GPI-AP í spendýrum hafi eterlípíð-akkeri og efnafræðileg uppbygging þess sé mjög frábrugðin mjög löngu asýlkeðjukeramíði, þá komst nýleg rannsókn að því að bæði lípíðin hafa þróunarlega svipaða eðlis- og efnafræðilega eiginleika og virkni (40). Þess vegna getur eterlípíðhlutinn í spendýrafrumum verið svipaður C26 keramíði í geri og hlutverk þess er að tengjast löngu keramíði í himnunni til að stuðla að samloðun og flokkun GPI-AP. Þó að þennan möguleika þurfi enn að prófa beint, styðja fyrri niðurstöður að flutningur löngu asýlkeðjukeramíðsins til Golgi-líkamsins sé ekki framkvæmdur af flutningspróteinum í umfrymi, heldur er háður myndun GPI-akkera eins og í geri. Þess vegna virðist þróunarfræðilega íhaldssama ferlið geta flutt mjög langar asýlkeðju-ceramíð og GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) saman í sömu flutningsblöðru.
Í ger- og spendýrafrumukerfum, þar sem póluð þekjufrumna eru í póluðum þekjufrumum, á sér stað samloðun og aðskilnaður GPI-AP frá öðrum himnupróteinum áður en þau ná frumuyfirborði. Paladino o.fl. (48) komust að því að á trjákrossinum í póluðum þekjufrumum spendýra er GPI-AP þyrping ekki aðeins nauðsynleg fyrir sértæka flokkun GPI-AP á topphimnu, heldur stjórnar hún einnig þyrpingaskipan GPI-AP og líffræðilegri virkni þeirra. Frumuyfirborð. Í geri sýndi þessi rannsókn að C26 keramíðháði GPI-AP þyrpingin á ER getur stjórnað þyrpingaskipan og virkni GPI-AP á himnunni (24, 49). Í samræmi við þetta líkan eru GhLag1 frumur ofnæmir fyrir GPI-hemlum eða lyfjum sem hafa áhrif á heilleika frumuveggja (28) og þörfin fyrir virka Gas1-GFP þyrpingu (49) á toppkeramíðinu sem varpað er fram í pörun gerfrumna bendir til mögulegra lífeðlisfræðilegra afleiðinga hLag1 frumna. GPI-AP villa. Hins vegar verður frekari rannsókn á því hvort virkni frumuyfirborðsins hafi verið forrituð frá ER með flokkunaraðferð byggða á lengd lípíða viðfangsefni framtíðarrannsókna okkar.
Saccharomyces cerevisiae stofnarnir sem notaðir voru í þessari vinnu eru taldir upp í töflu S1. MMY1583 og MMY1635 stofnarnir af SCLIM fyrir myndgreiningu lifandi frumna voru smíðaðir í bakgrunni W303. Þessir stofnar sem tjá Sec13-mCherry með flúrljómandi próteinmerki voru smíðaðir með því að nota PCR-byggða aðferð með pFA6a plasmíði sem sniðmát (23). Stofninn sem tjáir Mid2-iRFP merktan með flúrljómandi próteini undir stjórn GAL1 hvata var smíðaður á eftirfarandi hátt. PCR mögnun á iRFP-KanMx röð úr pKTiRFP-KAN vektor (gjöf frá E. O'Shea, Addgene plasmíðnúmer 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; rannsóknarauðkenni (RRID): Addgene_64687) og settur inn í C-enda innræns Mid2. Eftir að erfðamengisröð Mid2-iRFP hafði verið mögnuð og klónuð inn í GAL1 prómótorinn, var hún samþætt í Not I-Sac I staðsetningu samþættingarplasmíðsins pRS306. Plasmíðið pRGS7 sem myndaðist var línugert með Pst I til að samþættast í URA3 staðsetninguna.
Gas1-GFP samrunagenið er tjáð undir stjórn GAL1 hvata í miðjuþráðarplasmíði (CEN), sem er smíðað á eftirfarandi hátt. Gas1-GFP röðin var mögnuð með PCR úr pRS416-GAS1-GFP plasmíði (24) (gjöf frá L. Popolo) og klónuð í Xma I–Xho I staðsetningu CEN plasmíðisins pBEVY-GL LEU2 (gjöf frá C). Miller; Addgene plasmíðinúmer 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Plasmíðið sem myndaðist var nefnt pRGS6. Axl2-GFP samrunagenið er einnig tjáð undir stjórn GAL1 hvata pBEVY-GL LEU2 vektorsins, og smíði þess er á eftirfarandi hátt. Axl2-GFP raðgreiningin var mögnuð úr pRS304-p2HSE-Axl2-GFP plasmíði (23) með PCR og klónuð í Bam HI-Pst I staðinn á pBEVY-GL LEU2 vektornum. Plasmíðið sem myndaðist var nefnt pRGS12. Röð oligónúkleótíða sem notuð voru í þessari rannsókn er sýnd í töflu S2.
Stofninum var bætt við 0,2% adeníni og 2% glúkósa [YP-dextrósa (YPD)], 2% raffinósa [YP-raffinósa] ríku gerþykkni prótein p (YP) miðli (1% gerþykkni og 2% prótein ept). (YPR)] eða 2% galaktósa [YP-galaktósa (YPG)] sem kolefnisgjafa, eða í tilbúnum lágmarksmiðli (0,15% gerniturbasi og 0,5% ammóníumsúlfat) til að bæta við viðeigandi amínósýrur og basa sem nauðsynlegar eru fyrir næringu, og sem innihélt 2% glúkósa (tilbúið glúkósa lágmarksmiðil) eða 2% galaktósa (tilbúið galaktósa lágmarksmiðil) sem kolefnisgjafa.
Til rauntímamyndgreiningar voru hitanæmar sec31-1 stökkbreyttar frumur sem tjáðu smygildið undir GAL1 hvata ræktaðar í YPR miðli við 24°C yfir nótt þar til miðlungs log fasa. Eftir örvun í YPG við 24°C í 1 klukkustund voru frumurnar ræktaðar í SG við 37°C í 30 mínútur og síðan fluttar í 24°C til að losa þær úr seytingarblokkinni. Concanavalin A var notað til að festa frumurnar á glerskipu og myndaðar með SCLIM. SCLIM er samsetning af Olympus IX-71 öfugum flúrljómunarsmásjá og UPlanSApo 100×1.4 olíulinsu með tölulegri ljósopi (Olympus), hraðvirkum snúningsdisks-samfókusskanna með hátt merkis-til-hávaðahlutfall (Yokogawa Electric), sérsniðnum litrófsmæli og sérsniðinni kælingu. Myndmagnari kerfisins (Hamamatsu Photonics) getur veitt stækkunarlinsukerfi með lokastækkun upp á ×266.7 og hleðslutengdri myndavél sem margfaldar rafeindir (Hamamatsu Photonics) (21). Myndaöflun er framkvæmd með sérsniðnum hugbúnaði (Yokogawa Electric). Fyrir þrívíddarmyndir notuðum við sérsmíðaðan piezoelectric stýribúnað til að titra hlutlinsuna lóðrétt og söfnuðum sjónhlutunum 100 nm í sundur í stafla. Z-staflamyndin er breytt í þrívíddar voxelgögn og fræðilega punktdreifingarfallið sem notað er fyrir snúningsdisks-samfókussmásjána er notað til affellingarvinnslu með Volocity hugbúnaði (PerkinElmer). Með því að nota Volocity hugbúnað til að sjálfkrafa ákvarða þröskuld fyrir samstaðsetningargreiningu var ERES, þar með talið farmur, mælt. Línugreining var framkvæmd með MetaMorph hugbúnaði (Molecular Devices).
Notið GraphPad Prism hugbúnaðinn til að ákvarða tölfræðilega marktækni. Fyrir tvíhliða Student's t-próf ​​og venjulegt einhliða dreifingarpróf (ANOVA) er talið að munur milli hópa hafi marktæk áhrif á P <0,05 (*).
Fyrir flúrljómunarsmásjárskoðun á Gas1-GFP voru frumur úr log-fasa ræktaðar yfir nótt í YPD og safnað með skilvindu, þvegnar tvisvar með fosfatlausn og ræktaðar á ís í að minnsta kosti 15 mínútur og síðan undir smásjá eins og áður hefur verið lýst í athugun (24). Leica DMi8 smásjá (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) búin hlutlinsu, L5 (GFP) síu, Hamamatsu myndavél og Application Suite X (LAS X) hugbúnaði var notuð til öflunar.
Sýnin voru afeitruð með SDS sýnislausn við 65°C í 10 mínútur og síðan aðskilin með SDS-pólýakrýlamíð gel rafdrætti (PAGE). Fyrir ónæmisgreiningu voru 10 μl af sýni sett í hverja braut. Aðalmótefni: Notið kanínu fjölklónalegt mótefni gegn Gas1 í þynningu 1:3000, kanínu fjölklónalegt mótefni gegn Emp24 í þynningu 1:500 og kanínu fjölklónalegt mótefni gegn GFP (gjöf frá H. Riezman) í þynningu 1:3000. Músa einklónalegt mótefni gegn Pgk1 var notað í þynningu 1:5000 (gjöf frá J. de la Cruz). Aukamótefni: Piparrótperoxídasa (HRP) samtengt geitamótefni gegn kanínu ónæmisglóbúlíni G (IgG) notað í þynningu 1:3000 (Pierce). HRP-tengt geita-músar IgG var notað í þynningu 1:3000 (Pierce). Ónæmissvörunarsvæðið var athugað með efnaljómunaraðferð SuperSignal West Pico hvarfefnisins (Thermo Fisher Scientific).
Eins og lýst er í (31) var náttúruleg ónæmisútfellingartilraun framkvæmd á auðgaða ER-brotinu. Í stuttu máli, þvoðu gerfrumur með TNE-stuðpúða [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fenýlmetýlsúlfónýlflúoríð og próteasahemlablöndu) við 600 nm (OD600) við ljósþéttleika 100 tvisvar. Þær voru brotnar með glerperlum og síðan voru frumuleifar og glerperlur fjarlægðar með skilvindu. Yfirborðsvökvinn var síðan skilvinduður við 17.000 g í 15 mínútur við 4°C. Pelletið var enduruppleyst í TNE og digitalis saponíni var bætt við þar til lokastyrkur 1%. Upplausnin var ræktuð í 1 klukkustund með snúningi við 4°C og síðan voru óleysanlegir þættir fjarlægðir með skilvindu við 13.000 g við 4°C í 60 mínútur. Fyrir Gas1-GFP ónæmisútfellingu skal fyrst forrækta sýnið með tómum agarósa perlum (ChromoTek) við 4°C í 1 klukkustund og síðan rækta með GFP-Trap_A (ChromoTek) við 4°C í 3 klukkustundir. Ónæmisútfelldu perlurnar voru þvegnar fimm sinnum með TNE sem innihélt 0,2% digoxigenín, skolaðar með SDS sýnislausn, aðskildar á SDS-PAGE og greindar með ónæmisþynningu.
Eins og lýst er í (31) var framkvæmd þverbindingarákvörðun á auðgaða ER-brotinu. Í stuttu máli var auðgaða ER-brotið ræktað með 0,5 mM díþíóbis(súksínimídýlprópíónati) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, Bandaríkin; 20°C, 20 mín.). Þverbindingarviðbrögðin voru kæfð með því að bæta við glýsíni (50 mM lokastyrkur, 5 mínútur, 20°C).
Eins og áður hefur verið lýst (50) var framkvæmd MS greining á keramíði í villtum stofnum og GhLag1 stofnum. Í stuttu máli voru frumur ræktaðar í veldisstig (3 til 4 OD600 einingar/ml) í YPD við 30°C og 25×107 frumur voru teknar. Efnaskipti þeirra eru kæfð með tríklóróedíksýru. Notið útdráttarleysi [etanól, vatn, eter, pýridín og 4,2 N ammóníumhýdroxíð (15:15:5:1:0,018 v/v)] og 1,2 nmól af innri staðli C17 keramíði (860517, Avanti póllípíð gæði). Notið mónómetýlamín hvarfefni [metanól, vatn, n-bútanól og metýlamín lausn (4:3:1:5 v/v)] til að framkvæma vægt basískt vatnsrof á útdrættinum og notið síðan vatnsmettað n-bútanól til að afsalta. Að lokum var útdrátturinn enduruppleystur í jákvæðu leysi [klóróform/metanól/vatn (2:7:1) + 5 mM ammóníumasetat] og sprautaður inn í massagreinir. Fjölhvarfseftirlit (MRM) var framkvæmt til að bera kennsl á og magngreina sfingólípíð sameindir. TSQ Vantage þrívíddarfjórpóla massagreinirinn (Thermo Fisher Scientific) er búinn sjálfvirkri nanóflæðisjónagjafa, Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) fyrir lípíðgreiningu. Árekstursorkan er fínstillt fyrir hvern keramíðflokk. MS gögn voru fengin í jákvæðu stillingu. Fyrir hvert líffræðilegt endurtekið er lípíðmerkið miðgildi þriggja óháðra mælinga.
Eins og lýst er í (31) voru frumurnar (800×107) sem tjáðu Gas1-GFP látnar gangast undir náttúrulega ónæmisútfellingu. Hreinsaða Gas1-GFP var aðskilið með SDS-PAGE og flutt yfir á pólývínýlidenflúoríð (PVDF) himnu. Próteinið var sýnt fram á með því að lita PVDF með amíðsvörtu. Gas1-GFP bandið var klippt af PVDF og þvegið 5 sinnum með metanóli og einu sinni með vökvaskiljunar-MS (LC-MS) gæðum vatni. Með því að rækta himnuþráðinn með 500 μl af 0,3 M NaOAc (pH 4,0), stuðpúða og 500 μl af nýuppleystri 1 M natríumnítrítblöndu við 37°C í 3 klukkustundir, losnar lípíðhlutinn úr Gas1-GFP og er sundraður. Losun inósínfosfat keramíðs milli glúkósamíns og inósítóls (51). Eftir það var himnuþráðurinn þveginn fjórum sinnum með LC-MS gæðum vatni, þurrkuð við stofuhita og geymdur í köfnunarefnislofti við -80°C þar til greining fer fram. Sem samanburðarpróf var notað auðsýni af PVDF himnu í hverri tilraun. Lípíðinu sem var dregið út úr Gas1-GFP var síðan greint með MS eins og lýst er (50). Í stuttu máli voru PVDF ræmur sem innihéldu GPI-lípíð enduruppleystar í 75 μl af neikvæðu mótleysi [klóróform/metanól (1:2) + 5 mM ammóníumasetat] og fóru í gegnum rafúðajónunargreiningu (ESI)-MRM/MS greiningu á sfingólipíðtegundum (TSQ Vantage). Í þessu tilviki voru MS gögn fengin í neikvæðri jónastillingu.
Eins og áður hefur komið fram var lípíðhluti GPI-akkerisins aðskilinn frá [3H]-inositól-merktum GPI-AP (16). Lípíðin voru aðskilin með þunnlagsskiljun með leysiefnakerfi (55:45:10 klóróform-metanól-0,25% KCl) og sýnd með FLA-7000 (Fujifilm).
Frumur sem tjáðu Gas1-GFP (600×107) voru þvegnar tvisvar með TNE stuðpúða, brotnar með glerperlum og síðan skilvindaðar til að fjarlægja frumuleifar og glerperlur. Ofanfljótandi vökvinn var síðan skilvindaður við 17.000 g í 1 klukkustund við 4°C. Pelletið var þvegið í TNE og ræktað með 1 U PI-PLC (Invitrogen) í TNE sem innihélt 0,2% digitalis saponín í 1 klukkustund við 37°C. Eftir ensímmeðferðina var himnan fjarlægð með skilvindingu við 17.000 g við 4°C í 1 klukkustund. Til að ónæmisfella Gas1-GFP út var ofanfljótandi vökvinn ræktaður með GFP-Trap_A (ChromoTek) við 4°C yfir nótt. Hreinsað Gas1-GFP, aðskilið með SDS-PAGE, var litað með Coomassie briljant blue. Litunarröndin Gas1-GFP var skorin af gráa svæðinu sem umlykur vatnsveituna, og eftir alkýleringu með joðasetamíði og afoxun með díþíóþreitóli var melting í gelinu með trypsíni framkvæmd. Tryptisk peptíð og peptíð voru útdrátt og þurrkuð með GPI-glýkönum. Þurrkaða peptíðið var leyst upp í 20 μl af vatni. Sprautaðu hluta (8μl) í LC. Oktadecylsilan (ODS) súla (Develosil 300ODS-HG-5; innra þvermál 150 mm × 1,0 mm; Nomura Chemical, Aichi hérað, Japan) var notuð til að aðskilja peptíð við ákveðin stigulskilyrði. Færanlega fasinn er leysir A (0,08% maurasýra) og leysir B (0,15% maurasýra í 80% asetónítríl). Accela HPLC kerfi (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) var notað til að skola dálkinn út með leysi A innan 55 mínútna við rennslishraða 50 μl á mínútu í 5 mínútur, og síðan var styrkur leysi B aukinn í 40%. (Bandaríkin). Skolunin var stöðugt sett inn í ESI jóngjafann, og tryptíðin og peptíðin með GPI-glýkönum voru greind með LTQ Orbitrap XL (blönduð línuleg jónagildra-sporbrautarmassagreinir; Thermo Fisher Scientific). Í MS uppsetningunni var spenna háræðargjafans stillt á 4,5 kV, og hitastig flutningsháræðisins haldið við 300°C. Háræðisspennan og rörlinsuspennan voru stillt á 15 V og 50 V, talið í sömu röð. MS gögn voru fengin í jákvæðri jónastillingu (upplausn 60.000; massa nákvæmni 10 hlutar á milljón) í massabilinu 300/m/z massa/hleðsluhlutfall (m/z) 3000. MS/MS gögnin eru fengin í gegnum jónagildruna í LTQ Orbitrap XL [fyrstu 3 tölustafirnir sem gögnin byggja á, árekstrarvöld sundrun (CID)].
MD hermir voru framkvæmdar með GROMACS (52) hugbúnaði og MARTINI 2 kraftsviði (53-55). CHARMM GUI himnubyggirinn (56, 57) var síðan notaður til að smíða tvílag sem innihélt díóleóýlfosfatidýlkólín (DOPC) og Cer C18 eða DOPC og Cer C26. Upprunafræði og hnit Cer C26 eru fengin úr DXCE með því að fjarlægja auka perlurnar úr sphingosín hala. Notið ferlið sem lýst er hér að neðan til að jafna tvöfalda lagið og keyra það, notið síðan síðustu hnit kerfisins til að smíða kerfi sem inniheldur Emp24. Himnusvæði gersins Emp24 (leifar 173 til 193) var smíðað sem α-helix með því að nota sameindabyggingu sjónræns MD (VMD) tólsins (58). Síðan, eftir að skarast lípíð höfðu verið fjarlægð, var próteinið grófkornað og sett inn í tvílagið með því að nota CHARMM GUI. Lokakerfið inniheldur 1202 DOPC og 302 Cer C26 eða 1197 DOPC og 295 Cer C18 og Emp24. Jónið kerfið í styrk upp á 0,150 M. Fjórar óháðar endurtekningar voru gerðar fyrir tvær tvílaga samsetningar.
Tvöfalt lípíðlag er jafnað með CHARMM GUI aðferðinni, sem felur í sér að lágmarka og síðan jafna 405.000 skref, þar sem staðsetningartakmarkanir eru smám saman minnkaðar og fjarlægðar, og tímaskrefið er aukið úr 0,005 ps í 0,02 ps. Eftir jafnvægisstillingu framleiðir það 6 µs með tímaskrefinu 0,02 ps. Eftir að Emp24 hefur verið sett inn, notaðu sama CHARMM GUI aðferð til að lágmarka og jafna kerfið, og keyrðu síðan í 8 sekúndur í framleiðslu.
Fyrir öll kerfin er þrýstingurinn stjórnaður með Berendsen loftþrýstingsmæli (59) meðan á jöfnunarferlinu stendur, og með Parrinello-Rahman loftþrýstingsmæli (60) meðan á framleiðsluferlinu stendur. Í öllum tilvikum er meðalþrýstingurinn 1 bar og notað er hálf-ísótrópískt þrýstingstengingarkerfi. Í jöfnunar- og framleiðsluferlinu er hitastillir (61) með hraðakvörðun notaður til að tengja hitastig próteina, lípíða og leysiefna, talið í sömu röð. Markhitastigið er 310K meðan á allri aðgerðinni stendur. Óbindandi víxlverkun er reiknuð með því að búa til pörunarlista með Verlet-kerfinu með 0,005 vikmörkum. Coulomb-liðurinn er reiknaður með því að nota hvarfsviðið og 1,1 nm mörkunarfjarlægð. Vander Waals-liðurinn notar mörkunarkerfi með 1,1 nm mörkunarfjarlægð, og Verlet-mörkunarkerfið er notað fyrir hugsanlega rek (62).
Með því að nota VMD er afmörkunarbylgjulengdin milli DOPC fosfatperla eða keramíð AM1 perla og próteinsins 0,7 nm og fjöldi lípíða sem hafa samskipti við próteinið er reiknaður út. Reiknið út eyðingar-auðgunarstuðulinn (DE) samkvæmt eftirfarandi formúlu eins og í (63): DE þáttur = (magn heildarlípíða í próteininu 0,7) í próteininu 0,7 (magn Cer í heildarlípíðum)
Tilkynnt gildi er fengið sem meðaltal og villustikurnar eru fjórar óháðar eintök af sjálfsákvörðunarstuðlinum (SE). Tölfræðileg marktækni DE-þáttarins er reiknuð með t-prófi [(meðaltalDE-þáttar-1)/SE]. Reiknið p-gildi út frá einhliða dreifingu.
GROMACS tólið var notað til að reikna út tvívítt hliðarþéttleikakort af kerfinu sem inniheldur Emp24 innan síðustu 250 ns ferilsins. Til að fá auðgunar-/eyðingarkort af keramíði er þéttleikakortið af Cer deilt með summu kortsins af Cer og DOPC og síðan deilt með styrk Cer í líkamanum. Sami litakortskvarði er notaður.
Sjá nánari upplýsingar um þessa grein á http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Þessi grein er aðgengileg öllum samkvæmt skilmálum Creative Commons Attribution-Non-Commercial leyfisins, sem leyfir notkun, dreifingu og fjölföldun í hvaða miðli sem er, svo framarlega sem endanleg notkun er ekki í viðskiptalegum tilgangi og forsenda þess er að upprunalega verkið sé rétt. Heimild.
Athugið: Við biðjum þig aðeins um að gefa upp netfangið þitt svo að sá sem þú mælir með á síðunni viti að þú vilt að viðkomandi sjái tölvupóstinn og að hann sé ekki ruslpóstur. Við munum ekki safna neinum netföngum.
Þessi spurning er notuð til að kanna hvort þú sért gestur og koma í veg fyrir sjálfvirka ruslpóstsendingu.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero (Serez-Linero), Mier Sergio Linopez (S. (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Þrívíddarmyndgreining í háskerpu í rauntíma sýnir mikilvægi lengdar keramíðkeðjunnar fyrir próteinflokkun í sértækum framleiðslustöðum.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero (Serez-Linero), Mier Sergio Linopez (S. (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Þrívíddarmyndgreining í háskerpu í rauntíma sýnir mikilvægi lengdar keramíðkeðjunnar fyrir próteinflokkun í sértækum framleiðslustöðum.
©2020 American Association for the Advancement of Science. allur réttur áskilinn. AAAS er samstarfsaðili HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef og COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.