Þakka þér fyrir að heimsækja Nature.com. Vafraútgáfan sem þú notar styður CSS takmarkað. Til að fá sem bestu upplifun mælum við með að þú notir uppfærðan vafra (eða slökkvir á samhæfingarstillingu í Internet Explorer). Á meðan, til að tryggja áframhaldandi stuðning, munum við birta síðuna án stíla og JavaScript.
Ólíkt hryggdýrum er almennt talið að skordýr skorti karlkyns kynhormón. Í Anopheles gambiae virðist ekdýsonsteríðið 20-hýdroxýekdýson (20E) hafa þróast til að stjórna eggjaþroska þegar kvenkyns moskítóflugur mynda þær2 og til að valda mökunarþolstímabili þegar þær berast kynferðislega af karldýrum3. Þar sem eggjaþroski og mökun eru nauðsynlegir æxlunareiginleikar gæti skilningur á því hvernig kvenkyns Anopheles moskítóflugur samþætta þessi hormónamerki auðveldað hönnun nýrra malaríuvarnaráætlana. Hér sýnum við fram á að þessar æxlunarstarfsemi er stjórnað af mismunandi kynhormónum í gegnum flókið net af ekdýsteróíðvirkjandi/óvirkjandi ensímum. Við greindum karlkyns sértækt oxað ekdýson, 3-dehýdró-20E (3D20E), sem verndar foreldrahlutann með því að loka fyrir kynferðislega móttækileika kvenna eftir kynferðislega flutning og virkjun með affosfórun. Athyglisvert er að 3D20E flutningur örvaði einnig tjáningu æxlunargena sem viðhalda eggjaþroska meðan á Plasmodium sýkingu stendur, sem tryggir heilsu sýktra kvenna. Kvenkyns 20E vekur ekki kynferðislega svörun, en gerir mökunarhæfum einstaklingum kleift að verpa eggjum eftir að 20E-hömlunarkínasar eru hamlaðir. Greining þessa karlkyns skordýrasterahormóns og hlutverk þess í að stjórna kynferðislegri móttækileika kvenna, frjósemi og samskiptum við Plasmodium bendir til möguleika á að draga úr æxlunarárangri moskítóflugna sem bera malaríu.
Malaríutilfelli og dauðsföll eru að aukast aftur4 vegna útbreiddrar skordýraeiturþols hjá Anopheles-mýflugum, einu smitberunum sem bera malaríusníkjudýr í mönnum. Mökunarlíffræði þessara moskítóflugna er sérstaklega aðlaðandi skotmark fyrir nýjar aðgerðir gegn malaríu þar sem kvenkyns moskítóflugur makast aðeins einu sinni5; að gera þennan eina mökunaratburð ófrjósaman hefði mikla möguleika á að draga úr moskítóflugnastofninum á vettvangi.
Konur verða kynferðislega óhæfar eftir að hafa fengið sterahormóna í háum títra frá körlum. Rannsóknir hafa sýnt að það sem veldur erfiðleikum við frekari mökun er 20-hýdroxýecdýson (20E), sterahormón sem er betur þekkt sem stjórnandi á fellingarferlinu á lirfustigi. Hæfni karldýra til að mynda og flytja 20E hefur þróast sérstaklega í Anopheles tegundum sem eru hluti af undirættkvíslinni Cellia7, sem er útbreidd í Afríku og inniheldur hættulegustu flutningsaðila malaríu, þar á meðal Anopheles gambiae. Þetta er sérstaklega athyglisvert vegna þess að í þessum tegundum framleiða kvendýr einnig 20E eftir hverja blóðmáltíð og 20E knýr eggmyndunarferlið (sjá tilvísun 8). Hins vegar er lítið vitað um hvernig kvendýr samþætta merki frá tveimur mismunandi uppsprettum ecdýsons (flutningur karldýra og blóðfóðrunarörvun) án þess að skerða eigin getu til að makast. Reyndar, ef 20E sem kvendýrin framleiða veldur kynferðislegu óþoli, mun það leiða til ófrjósemi hjá einstaklingum sem eru óléttir, sem er mjög algeng hegðun hjá þessum moskítóflugum5.
Möguleg skýring er sú að karldýr af tegundinni A. gambiae flytja breytt karlkyns sértækt ekdýsón, sem virkjar boðleiðir í kvenkyns æxlunarfærum, sem leiðir til óstöðugleika í mökun. Hins vegar, þó að hryggdýr hafi marga sterahormóna, svo sem estrógen og andrógen (skoðað í tilvísun 9), þá vitum við ekki til þess að andrógenbundnir sterar hafi fundist í skordýrum.
Við lögðum af stað til að ákvarða safn sterahormóna í karlkyns fylgikirtli (MAG) kynþroska A. gambiae í leit að mögulegum breytandi sterum. Með því að nota háþrýstivökvaskiljun ásamt tandem massagreiningu (HPLC-MS/MS) frekar en þá minna sértæku aðferð sem áður var notuð, greindum við ekdýson (E) og 20E í þessum vef, sem staðfestir fyrri niðurstöður. Hins vegar var sýnið ríkjandi af oxuðum fosfórýleruðum sterum, í samræmi við formúluna 3-dehýdró-20E-22-fosfat (3D20E22P)12 (Mynd 1). Aðrar form eru 3-dehýdró-20E (3D20E) og 20E-22-fosfat (20E22P). HPLC-MS/MS merkjastyrkur 3D20E22P var tveimur stærðargráðum hærri en affosfórýleraða form þess, 3D20E, og þremur stærðargráðum hærri en E og 20E (Mynd 1). Þó að í öðrum hlutum líkamans og ... neðri æxlunarfæri (LRT; Ítarleg gögn mynd 1a). Við greindum einnig ecdysteroids í nýlokuðum (<1 dags gömlum) körlum og kvenkyns frumum og greindum aðeins 3D20E og 3D20E22P í MAG; E, 20E og 20E22P voru til staðar hjá báðum kynjum (Ítarleg gögn mynd 1b). Þessi gögn benda til þess að fullorðnir karlkyns einstaklingar af A. gambiae framleiði mikið magn af breytandi hormónum í MAG frumum sínum sem kvenkyns frumur mynda ekki.
MAG og kvenkyns LRT (þar með talið gátt, sáðblöðrur og parvarium) voru krufin úr 4 daga gömlum (4 daga gömlum) meyjum og meyjum og pöruðum kvenkyns (0,5, 3 og 12 hpm). Ecdysone í þessum vefjum var greint með HPLC-MS/MS (meðaltal ± sem; óparað t-próf, tvíhliða, leiðrétt fyrir falskar uppgötvunartíðni (FDR); NS, ekki marktækt; *P < 0,05, **P < 0,01. 3D20E: 3 klukkustundir á móti 0,5 klukkustundum, P = 0,035; 12 klukkustundir á móti 3 klukkustundum, P = 0,0015; 12 klukkustundir á móti 0,5 klukkustundum, P = 0,030. 3D20E22P: 3 klukkustundir á móti 0,5 klukkustundum, P = 0,25; 12 klukkustundir á móti 3 klukkustundum, P = 0,0032; 12 klukkustundir á móti 0,5 klukkustundum, P = 0,015). Gögnin eru úr þremur líffræðilegum endurtekningum. Hámarksflatarmál hvers ecdysone sem um ræðir var reiknað og staðlað með fjölda moskítóflugna. Ecdysone er táknað með lit á eftirfarandi hátt: E, grænt; 20E, appelsínugult; 20E22P, fjólublátt; 3D20E, blátt; 3D20E22P, bleikt. Innskotið stækkar kvarðann á y-ásnum til að sýna lægra ecdysone magn.
Til að kanna hvort 3D20E22P og 3D20E berast við mökun, greindum við kvenkyns sterahormóna (LRT) á ýmsum tímapunktum eftir mökun. Þó að ecdysone hafi ekki fundist í meyjum, sáum við verulegt magn af 3D20E22P í LRT strax eftir mökun (0,5 klst. eftir mökun, hpm), sem minnkaði með tímanum, en 3D20E gildi jukust verulega (Mynd 1). Með því að nota efnafræðilega myndað 3D20E sem staðal, komumst við að því að magn þessa sterahormóns í mökunar-LRT var að minnsta kosti 100 sinnum hærra en 20E (Tafla 1 með ítarlegum gögnum). Þannig er 3D20E22P helsta karlkyns ecdysonið sem flyst til kvenkyns LRT við mökun, og affosfórýlerað form þess, 3D20E, verður mjög algengt stuttu eftir mökun. Þetta bendir til mikilvægs hlutverks síðarnefnda ecdysonsins í líffræði kvenna eftir mökun.
Eftir að hafa búið til nýtt RNA raðgreiningargagnasett (RNA-seq) (mynd 2a), með því að nota sérsmíðaða lífupplýsingafræðileiðslu, leituðum við að ecdysone kínasa (EcK), ecdysone oxidase (EO) og ecdysone sem umritar 20E-breytt fosfatasa geni. EPP) er tjáð í æxlunarvefjum. Við greindum eitt hugsanlegt EPP gen og tvö hugsanleg EcK gen (EcK1 og EcK2), en fundum ekki gott hugsanlegt EO gen. Athyglisvert er að einstök EPP gen voru tjáð í miklu magni (98,9 prósent) í gambískum MAG en ekki í kvenkyns LRT frumum (mynd 2b), öfugt við væntingar okkar þar sem affosfórun 3D20E22P átti sér stað í þessum kvenkyns vef. Þess vegna teljum við að karlkyns EPP gæti borist við mökun. Reyndar notuðum við in vivo stöðuga samsætumerkingu til að hylja kvenkyns próteinið eftir mökun, ensím sem greint er með MS í kvenkyns gátt (mynd 2c og viðbótartafla 1). Tilvist ... EPP í MAG og paraðri (en ekki mey) kvenkyns LRT var einnig staðfest með sértækum mótefnum (mynd 2d).
a, Sérsmíðuð lífupplýsingaleiðsla til að leita í æxlunarvefjum beggja kynja að genum sem kóða fyrir EcK, EO og EPP. Tölurnar við hliðina á örvunum gefa til kynna fjölda karlkyns og kvenkyns umsækjenda í hverju skrefi. Þessi greining benti á eitt EPP gen (EPP) og eitt EcK gen (EcK1) sem eru tjáð í körlum, og eitt EcK gen (EcK2) sem er tjáð í báðum kynjum en gefur ekki til kynna EO gen. b, Hitakort sem ber saman tjáningu umsækjenda í vefjum Anopheles gambiae (V) og mökunar (M) Anopheles albicans. Spca, frjóvgun; MAG, aukakirtlar í körlum; aðrir líkamshlutar, þar á meðal brjóst, vængir, fætur, fituvefir og innri líffæri hjá báðum kynjum og eggjastokkar hjá konum. EcK2 er mikið tjáð bæði í MAG og gáttum Gambíu, en EPP finnst aðeins í MAG.c, Próteómgreining á flutningi sáðlátshóps karlkyns í gáttir kvenna við 3, 12 og 24 hpm, sem sýnir 67 algengustu próteinin. Kvenkyns dýr voru alin upp á mataræði sem innihélt 15N til að merkja (og hylja) öll prótein. Ómerktir karldýr voru pöruð við merktar konur og LRT kvenkyns dýr voru krufð við 3, 12 og 24 hpm fyrir próteómgreiningu (sjá viðbótartöflu 1 fyrir fullan lista yfir sáðlátsprótein). Innskot, EPP, Eck1 og EcK2 voru greind í MAG hjá meyjum karldýrum með próteómgreiningu á þessum vefjum.d, EPP var greint með western blot í MAG og LRT hjá pöruðum konum, en ekki í meyjum konum eða körlum eða restinni af kvenlíkamanum. Himnur voru samtímis Prófað með mótefnum gegn aktíni (hleðslustýring) og EPP-mótefnum. Allir karlmenn eru hreinir meyjar. Sjá viðbótarmynd 1 fyrir gögn um geluppruna. Western blots voru framkvæmd tvisvar með svipuðum niðurstöðum.
Virkni ecdysteroid fosfófosfatasa í EPP var staðfest eftir ræktun með HPLC-MS/MS með 3D20E22P einangruðu úr MAG (Ítarleg gögn mynd 2a). Ennfremur, þegar við þögguðum EPP með RNA-miðlaðri truflun (RNAi), greindum við mikla minnkun á fosfatasa virkni í æxlunarvef þessara karldýra (Mynd 3a), og kvendýr sem pöruðust við EPP-þögguð karldýr sýndu marktækt lægra hlutfall affosfórýleraðs 3D20E (Mynd 3b) þrátt fyrir að hluta til þöggun gena (Ítarleg gögn mynd 2b, c). Aftur á móti greindum við ekki marktækar breytingar á 20E22P/20E hlutfallinu í sömu moskítóflugum, sem gæti bent til þess að ensímið sé sértækt fyrir 3D20E22P (Mynd 3b).
a, Minnkuð fosfatasa virkni í MAG af völdum EPP þöggunar með tvíþátta EPP RNA (dsEPP) eða tvíþátta GFP RNA (dsGFP) samanburðarhópum. Tuttugu MAG hópar voru notaðir í hverri endurtekningu (P = 0,0046, parað t-próf, tvíhliða), táknað með aðskildum punktum. b, Kvenkyns einstaklingar sem pöruðust við EPP-þögguð karldýr höfðu marktækt lægra hlutfall affosfórýleruðu 3D20E við 3 hpm (P = 0,0043, óparað t-próf, tvíhliða), en 20E gildi voru óbreytt (P = 0,063, óparað). t-próf, tvíhliða). Gögn eru kynnt sem meðaltal ± semígildi úr þremur hópum með 13, 16 og 19 kvendýrum hvor.c, Kvendýr sem pöruðust við karldýr sem höfðu verið þaggað niður með EPP höfðu marktækt hærri tíðni endurpörunar (P = 0,0002, Fishers nákvæmnispróf, tvíhliða). Kvendýr voru fyrst neydd til að parast til að tryggja pörunarstöðu sína; Tveimur dögum síðar voru þau sett í samband við önnur karldýr sem báru erfðabreyttar sæði til að meta endurpörunartíðni með megindlegri PCR greiningu á erfðabreytta geninu.d, Blóðfóðraðar kvendýr sem pöruð voru við EPP-þögguð karldýr höfðu marktækt minnkaða frjósemi (P < 0,0001; Mann-Whitney próf, tvíhliða) og lítillega minnkaðan eggjafjölda (P = 0,088, Mann-Whitney próf, tvíhliða), en hrygningatíðnin var óbreytt (P = 0,94, Fishers nákvæmnispróf, tvíhliða). Í öllum spjöldum táknar n fjölda líffræðilega óháðra moskítóflugnasýna.NS, ekki marktækt. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
Næst metum við hvort affosfórun ecdysone sé mikilvæg til að örva mökunarþol hjá kvendýrum. Athyglisvert er að kvendýr sem pöruðust við karldýr með EPP-tæmt pöruðust aftur með mun hærri tíðni (44,9%) en samanburðarkvendýr (10,4%) þegar þau voru útsett fyrir fleiri (erfðabreyttum) karldýrum (Mynd 3c). Við sáum einnig marktæka minnkun á frjósemi (Mynd 3d, vinstra megin) og lítilsháttar minnkun á fjölda eggja sem þessar kvendýr verpa (Mynd 3d, miðja), en hlutfall eggja sem kvendýr verpa (önnur svörun sem kvendýrin fengu við mökun) varð ekki fyrir áhrifum (Mynd 3d, hægra megin). Miðað við þá sértækni sem EPP hefur sést fyrir 3D20E22P benda þessar niðurstöður til þess að virkjun 3D20E með EPP sem flyst við mökun geti gegnt mikilvægu hlutverki í að slökkva á móttækileika kvenna fyrir frekari mökun, hegðun sem áður var eignuð kynferðislegri flutningi 20E. Þess vegna hefur þetta karlkyns sértæka hormón einnig sterk áhrif á frjósemi kvenna.
Næst bárum við saman virkni 20E og 3D20E í inndælingartilraunum í kynþroskuðum meyjum með því að nota efnafræðilega myndað 3D20E (mynd 4a-c) og 20E sem er fáanlegt í verslunum. Við komumst að því að 3D20E var marktækt áhrifaríkara en 20E við að slökkva á næmi kvendýra fyrir mökun við báða styrkleika (mynd 4d). Athyglisvert er að helmingur lífeðlisfræðilegs magns 3D20E í LRT (1.066 pg eftir inndælingu samanborið við 2.022 pg eftir mökun) olli hlutfalli þrálátra kvendýra sem var 20 sinnum hærra en lífeðlisfræðilegt magn 20E (361 pg eftir inndælingu) 24 klukkustundum eftir inndælingu við hæsta styrk 18 pg eftir mökun; Tafla 1 í útvíkkuðum gögnum). Þessi niðurstaða er í samræmi við þá hugmynd að kynferðisleg flutningur 20E valdi ekki mökunarþolnum tímabilum og bendir enn fremur á 3D20E sem mikilvægan þátt í að tryggja samband foreldra og barna. 3D20E var einnig marktækt virkara en 20E í eggjavarpsprófum hjá meyjum (Mynd 4e), sem bendir til þess að eðlilegur eggjavarpshraði sem við sáum eftir að hluta til var þöggun á EPP stafaði af tilvist leifar af 3D20E virkni sem enn var framleidd af mökunarvöldum kvenkynsþáttum.
(a,b) 3D20E efnafræðilega myndað úr 20E (a) með mjög mikilli umbreytingu/nýtni (gögn kynnt sem meðaltal ± sem úr þremur óháðum myndunarviðbrögðum) (b).c, Massaróf (neðri helmingur) passar nákvæmlega við ecdysone sem finnst í pöruðum kvenkyns LRT (efri helmingur).d, Samanborið við 20E (0,63 µg, P = 0,02; 0,21 µg, P < 0,0001; Fishers nákvæmnispróf, tvíhliða) og 10% etanól (0,63 µg, P < 0,0001; 0,21 µg, P < 0,0001; Fishers nákvæmnispróf, tvíhliða), en 20E var marktækt hærra en samanburðarhópurinn aðeins við hærri skammta (0,63 µg, P = 0,0002; 0,21 µg, P = 0,54; Fishers nákvæmnispróf, tvíhliða).e, 3D20E Innspýting olli marktækt hærri hrygningartíðni hjá óspilltum kvendýrum en samanburðarhópnum sem fékk 10% etanól (0,21 µg, P < 0,0001; 0,13 µg, P = 0,0003; Fishers nákvæmnispróf, tvíhliða), en 20E var samanborið við samanburðarhópinn. Aðeins við hærri skammta (0,21 µg, P = 0,022; 0,13 µg, P = 0,0823; Fishers nákvæmnispróf, tvíhliða). 3D20E olli marktækt hærri hrygningartíðni en 20E við hærri skammta (0,21 µg, P = 0,0019; 0,13 µg, P = 0,075; Fishers nákvæmnispróf, tvíhliða). Í öllum spjöldum táknar n fjölda líffræðilega óháðra moskítóflugnasýna. NS, ekki marktækt. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001. Gögn eru frá þrjár endurtekningar.
Í fyrri rannsóknum höfum við komist að því að kynferðisleg flutningur sterahormóna örvar tjáningu MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11), kvenkyns æxlunargen sem verndar kvenkyns A. gambiae gegn P. falciparum sýkingu. Heilsufarskostnaður af völdum 13, banvænasta malaríusníkjudýrsins í mönnum. Í ljósi mikilvægis MISO fyrir æxlunarhæfni Anopheles á svæðum þar sem malaría er landlæg, ákváðum við að ákvarða hvaða hormón 3D20E eða 20E kveikir á tjáningu þessa gens. Við komumst að því að þó að 20E innspýting örvaði sérstaklega eða öflugra suma kjarnahormónaviðtaka (HR), svo sem HR3 og HR4, og dæmigerð steramarkmið niðurstreymis, svo sem eggjastokkagenin Vg14, 15, 16, var MISO sterkari þegar það var örvað af 3D20E (Ítarleg gögn mynd 3). Þannig virðist kynferðisleg flutningur þessa andrógena sterahormóns örva ferla sem vernda kvenkyns frá kostnaði sem sníkjudýrasýking hefur í för með sér. Ennfremur hefur 3D20E mismunandi áhrif á bæði ísóformin af E viðtakinn EcR, sem örvar EcR-A og bælir EcR-B, og virkjar sterkar önnur mökunarörvandi gen, þar á meðal HPX15, sem hefur áhrif á frjósemi kvenna. Þetta gæti skýrt þá verulegu ófrjósemi sem sést hjá kvenkyns einstaklingum sem parast við karldýr sem hafa verið þögguð með EPP (Ítarleg gögn mynd 3). Þessi gögn benda til tilvistar niðurstreymisferla sem eru helst virkjaðir af tveimur ecdysone hormónum sem gætu legið að baki kynsértækri virkni.
Næst prófuðum við virkni tveggja EcK gena sem greind voru í lífupplýsingafræðiferli okkar. Þöggun á EcK1 eða EcK2 leiddi til verulegrar dánartíðni hjá körlum (Ítarleg gögn mynd 4a), sem bendir til þess að fosfórun ecdysone, og þar með óvirkjun, sé mikilvæg fyrir lifun. Þar sem EcK2 var tjáð í hærra magni en EcK1 og greindist í MAG með próteómfræði (Mynd 2b, c og viðbótartafla 2), staðfestum við virkni þess sem ecdysteroid kínasa með því að rækta það með 20E, sem leiddi til fosfórunar 20E22P (Ítarleg gögn mynd 2).4b). Þegar 3D20E var notað sem hvarfefni gátum við ekki greint fosfóreraða afurðina 3D20E22P (Ítarleg gögn mynd 4c), sem bendir til þess að 20E frekar en 3D20E gæti verið ákjósanlegt markmið EcK2.
Samkvæmt RNA-raðgreiningu okkar var EcK2 einnig mjög tjáð í LRT hjá meyjum, þar sem það var slökkt eftir mökun (Mynd 2b). Við staðfestum þessi gögn og komumst að því að blóðgjöf hafði ekki áhrif á EcK2 tjáningu (Ítarleg gögn, mynd 5a). Með því að útvíkka upphaflegu MS tilraunirnar okkar komumst við að því að hámark 20E22P var nátengt hámarki 20E (22-26 klukkustundum eftir blóðmáltíð; Ítarleg gögn, mynd 5b). Þöggun EcK2 hjá meyjum leiddi til þrefaldrar aukningar á hlutfalli 20E og 20E22P 26 klukkustundum eftir blóðmáltíð (Ítarleg gögn, myndir 2c og 5c), sem staðfestir að EcK2 fosfórýlerar einnig 20E hjá konum. Athyglisvert er að EcK2-tæmdar meyjur héldu fullri kynferðislegri móttækileika (Ítarleg gögn, mynd 5d, e), sem bendir enn frekar til þess að framleiðsla 20E hjá konum valdi ekki mökunarþolnum tímabilum. Hins vegar höfðu þessar konur marktækt... aukin eggjavarpshraði samanborið við samanburðarhóp, þar sem meira en 30% meyja verpa eggjum (Ítarleg gögn mynd 5f). Ef tvíþátta Eck2 RNA (dsEcK2) inndælingar voru framkvæmdar eftir blóðtöku, átti sér ekki stað hrygning, og þá hafði 20E hámarkið vegna blóðtöku minnkað. Í heildina styðja þessar niðurstöður líkan um að 20E sem framleitt er eftir blóðsogi geti örvað hrygningu, en aðeins þegar hrygningarblokkunin (EcK2 og hugsanlega aðrir þættir) er slökkt á við mökun. Hvorki 20E né 3D20E inndælingar hamluðu EcK2 tjáningu í meyjar (Ítarleg gögn mynd 5g), sem bendir til þess að aðrir þættir miðli hömlun þessa kínasa. Hins vegar voru 20E gildi eftir blóðtöku ekki nægileg til að valda óþægindum við mökun, heldur voru þau í raun kveikt af háum títra af kynferðislega smitaðri 3D20E.
Niðurstöður okkar veita mikilvæga innsýn í þá ferla sem stjórna æxlunarárangri A. gambiae. Fram hefur komið líkan þar sem karldýr hafa þróast til að mynda mikið magn af 3D20E, karlkyns sértæku ecdysone sem tryggir ætterni með því að gera kvendýrin ónæm fyrir frekari mökun. Á sama tíma hafa þessir malaríuflutningsaðilar einnig þróað skilvirkt kerfi til að virkja 3D20E í kvendýrum sem svar við kynferðislegri flutningi karlkyns sértæks EPP. Okkur vitandi er þetta fyrsta dæmið um karlkyns og kvenkyns sterahormónakerfi sem gegnir einstöku og mikilvægu hlutverki í skordýrum. Karlkyns sértæk ecdysone virkni hefur verið sett fram en ekki endanlega sýnt fram á. Til dæmis er að mestu leyti afsönnuð tilgáta 18 sú að þessi virkni geti verið framkvæmd af 20E forveranum E1. Það er vel þekkt að í Drosophila er monandry hrundið af kynferðislegri flutningi lítilla kynpeptíða 19,20 sem hafa samskipti við taugafrumur sem tauga í æxlunarfæri kvenna í gegnum sértæka kynpeptíðviðtaka 21,22. Frekari vinna er nauðsynleg til að ákvarða niðurstreymismerkjagjöfina. kaskáðar sem 3D20E stjórnar í kvenkyns A. gambiae og til að ákvarða hvort hægt sé að varðveita þessa kaskáða milli moskítóflugna og Drosophila.
Í ljósi þess hve mikilvægt hlutverk 3D20E gegnir í frjósemi og hegðun kvenna, sem komu fram í rannsókn okkar, bjóða leiðirnar sem leiða til myndunar og virkjunar 3D20E upp á ný tækifæri fyrir framtíðar aðferðir til að stjórna moskítóflugum, svo sem að mynda samkeppnishæf, ófrjó karldýr í tækni fyrir ófrjó skordýr, sem hægt er að nota til að sleppa villtum skordýrum eða til að herma eftir 3D20E í leik meyjanna. Karlkynssértæk virkni 3D20E gæti hafa þróast þegar A. gambiae og aðrar Cellia tegundir fengu getu til að storkna sæði sínu í mökunartappa, þar sem þetta gerir kleift að flytja mikið magn hormóna og hormónavirkjandi ensíma á skilvirkan hátt. Þróun 3D20E sem innleiðir monandry veitir aftur á móti kvendýrum (með mikilli tjáningu MISO) til að efla æxlunarhæfni sína á svæðum með mikla malaríuútbreiðslu, sem óbeint stuðlar að Plasmodium smiti. Þar sem sýnt hefur verið fram á að kvenkyns 20E hefur djúpstæð áhrif á lifun og vöxt P. falciparum í kvenkyns Anopheles moskítóflugum,24 eru bæði karlkyns og kvenkyns sterahormónaleiðir nú lykilþættir í samskiptum moskítóflugna og sníkjudýra.
A. gambiae G3 stofnar voru ræktaðir við hefðbundnar skordýraaðstæður (26-28°C, 65-80% rakastig, 12:12 klst. ljós/myrkur ljóstímabil). Lirfurnar voru fóðraðar með fiskifóðri í duftformi (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets og Tetra Pond Sticks í hlutföllunum 7:7:2). Fullorðnar moskítóflugur voru fóðraðar að vild með 10% dextrósalausn og vikulegu mannsblóði (rannsóknarblóðþættir). Meyjarmoskítóflugur voru fengnar með því að aðgreina kynin á púpustigi eftir að endarnir voru skoðaðir með smásjá. Karlkyns moskítóflugur sem bera DsRed erfðabreyttu genið hafa verið lýst áður.
Tilraunir með nauðungarpörun voru framkvæmdar samkvæmt áður lýstum aðferðum. Fyrir náttúrulega pörun voru 4 daga gamlar meyjur haldnar í hlutfallinu 1:3 við kynþroska meyjar í tvær nætur. Í tilraunum þar sem karldýr voru sprautuð með dsEPP, var samhliða pörun í búrinu 3-4 dögum eftir inndælingu, þegar fosfatasa virkni var sem mest þögguð (Ítarleg gögn mynd 2b).
Vefir moskítóflugna, eftirstöðvar líkamans eða allur líkaminn voru krufnir í 100% metanól og blandaðir saman með perlutæki (2 mm glerperlur, 2.400 snúningar á mínútu, 90 sekúndur). Vefjafjöldi og metanólrúmmál var sem hér segir: afgangur líkamans, 50 í 1.000 µl; MAG, 50–100 µl; kvenkyns LRT, 25–50 µl. Botnfallið var dregið út með metanóli aftur með sama rúmmáli af metanóli. Frumuleifar voru fjarlægðar með skilvindu. Metanólið úr báðum útdráttum var sameinað og þurrkað undir köfnunarefnisflæði og síðan enduruppleyst í eftirfarandi rúmmáli af 80% metanóli í vatni: afgangur líkamans, 50 µl; MAG og kvenkyns LRT, 30 µl.
Sýni voru greind með massagreini (ID-X, Thermo Fisher) tengdum LC mælitæki (Vanquish, Thermo Fisher). 5 µl af sýninu var sprautað á 3 µm, 100 × 4,6 mm dálk (Inspire C8, Dikma) sem haldið var við 25°C. Færanlegu fasarnir fyrir LC voru A (vatn, 0,1% maurasýra) og B (asetónítríl, 0,1% maurasýra). LC hallinn var sem hér segir: 5% B í 1 mínútu, síðan aukið í 100% B á 11 mínútum. Eftir 8 mínútur við 100%, jafnvægið jafnast á við dálkinn við 5% B í 4 mínútur. Flæðishraðinn var 0,3 ml á mínútu. Jónun í MS uppsprettunni er framkvæmd með hitaðri rafúðajónun í jákvæðum og neikvæðum stillingum.
Massagreinirinn mælir gögn á m/z sviðinu frá 350 til 680 við 60.000 upplausn í fullri MS stillingu. MS/MS gögn voru aflað á [M + H]+ (öll skotmörk), [M - H2O + H]+ (öll skotmörk) og [M - H]- (fosfórýleruð skotmörk). MS/MS gögn voru notuð til að staðfesta eiginleika ekdýsons skotmarka sem enginn staðall var tiltækur fyrir. Til að bera kennsl á ómarkvissa ekdýstera voru MS/MS gögn fyrir alla HPLC tinda með >15% hlutfallslegt magn greind. Magngreinið með staðalkúrfum sem búnar voru til úr hreinum stöðlum (20E, 3D20E) til að reikna út algert magn eða þynningar af einu tilteknu sýni (öllum öðrum skotmörkum) til að reikna út jafngildi þeirra við magnið sem fannst í einum karlkyns sýni. Fyrir 3D20E var magngreining framkvæmd með því að nota summu eftirfarandi tengiefna: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Gögnum var safnað út og magngreint með Tracefinder (útgáfa 4.1). MS/MS gögn voru greind með Xcalibur (útgáfa 4.4). MS litróf E, 20E og 3D20E voru borin saman við viðkomandi staðla. 3D20E22P var greint með afleiðumyndun með Girard-hvarfefni. 20E22P var greint með m/z hlutfalli.
3D20E22P var hreinsað úr MAG. Hreinsun var framkvæmd á greiningarskala með því að nota afkastavökvaskiljöfnunartæki (Acquity, Waters) með fjórpóla massagreini (QDa, Acquity, Waters) við sömu LC-skilyrði og í HPLC-MS/MS greiningunni. Brotasöfnun hófst þegar m/z-gildið sem samsvarar 3D20E22P greindist við sama varðveislutíma og áður var ákvarðaður. Hreinleiki útdregnu efnasambandanna var síðan kannaður með HPLC-MS/MS eins og lýst er hér að ofan.
Heildar RNA var dregið út úr 10-12 æxlunarvefjum eða öðrum líkamshlutum (hauslaus) með TRI hvarfefni (Thermo Fisher) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. RNA var meðhöndlað með TURBO DNasa (Thermo Fisher). cDNA var myndað með Moloney músa hvítblæðisveiru öfugumritun (M-MLV RT; Thermo Fisher) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Grunnviðmið fyrir öfuga umritun magnbundna PCR (RT-qPCR; Útvíkkað gagnatafla 2) voru áður birt24 eða hönnuð með Primer-BLAST26, með forgangi gefin afurðum sem voru 70-150 bp að stærð og spönnuðu exon-exon tengi eða grunnviðmiðapör aðskilja exona. cDNA sýni úr þremur til fjórum líffræðilegum endurteknum voru þynnt fjórfalt í vatni fyrir RT-qPCR. Magngreining var framkvæmd í 15 µl af endurteknum viðbrögðum sem innihéldu 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), grunnviðmið og 5 µl af þynntu cDNA. Viðbrögðin voru keyrð á QuantStudio 6 Pro rauntíma. PCR kerfi (Thermo Fisher) og gögn voru safnað og greind með hönnun og greiningu (útgáfa 2.4.3). Eins og sýnt var fram á í þessari rannsókn voru hlutfallsleg magn staðlað miðað við ríbósómgenið RpL19 (AGAP004422), en tjáning þess breyttist ekki marktækt við blóðgjöf 27 eða pörun 3.
RNA gæði var kannað með Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent). Illumina pöruð-enda bókasöfn voru útbúin og keyrð við Broad Institute of MIT og Harvard. Raðgreiningarlestrar voru samstilltir við erfðamengi A. gambiae (PEST stofn, útgáfa 4.12) með því að nota HISAT2 (útgáfa 2.0.5) með sjálfgefnum breytum. Lestrar með kortlagningargæðastig (MAPQ) <30 voru fjarlægðir með Samtools (útgáfa 1.3.1). Fjöldi lestra sem tengdir voru genum var talinn með því að nota htseq-count (útgáfa 0.9.1) með sjálfgefnum breytum. Staðlaðar lestrartölur voru reiknaðar og mismunandi genatjáning greind með DESeq2 pakkanum (útgáfa 1.28.1) í R (útgáfa 4.0.3).
Gen sem breyta ecdysone voru greind með því að leita fyrst í erfðamengi A. gambiae með því að nota PSI-BLAST reikniritið (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), með því að nota sjálfgefin gildi fyrir breytur með eftirfarandi fyrirspurnarpróteinröð: frá Bombyx mori (aðgangsnúmer NP_001038956.1), Musca domestica (aðgangsnúmer XP_005182020.1, XP_005175332.1 og XP_011294434.1) og Microplitis demolitor (aðgangsnúmer XP_008552646.1 og XP_008552645.1) EcK frá B. mori (aðgangsnúmer NP_001036900), Drosophila melanogaster (aðgangsnúmer NP_651202), Apis mellifera. (Aðgangsnúmer XP_394838) og Acyrthosiphon pisum (Aðgangsnúmer XP_001947166); og EPP úr B. mori (Aðgangsnúmer XP_001947166) NP_001177919.1 og NP_001243996.1) og EO úr D. melanogaster (Aðgangsnúmer NP_572986.1) (skref 1). Næst skal sía niðurstöður út frá mikilli mRNA tjáningu (>100 brot/kílóbasa exón á milljón kortlagðar lestrar (FPKM) eða >85%) í æxlunarvef (kvenkyns LRT eða MAG) í Gambíu (skref 2). Til að bæta sértækni völdum við tilvonandi ensím sem eru einnig tjáð í æxlunarvef A. albimanus, anopheles tegundar sem hvorki myndar né flytur ecdysone við mökun. Tilvonandi gen voru síuð út frá lágri tjáningu (<100 FPKM eða <85. hundraðshluti) í æxlunarvef A. albimanus (skref 3). Sem lokasía (skref 4) þurfa tilvonandi gen að uppfylla að minnsta kosti eitt af eftirfarandi: (1) marktækt uppstýrt eftir mökun (P < 0,05) samkvæmt greiningu á mismunandi tjáðum genum og (2) í vefjum sem ekki eru tjáðir í æxlun (< 85% eða <100 FPKM).
Við breyttum áður lýstum aðferðum 28,29,30 til að ná fram samsætumerkingu á heilli lífveru. Í stuttu máli var villta gerðin Saccharomyces cerevisiae tegund II (YSC2, Sigma) prófuð í gerköfnunarefnisgrunni (BD Difco, DF0335) sem innihélt (þyngd/rúmmál) 2% glúkósa (G7528, Sigma), 1,7% amínósýrufrítt og ammóníumsúlfat (ræktunarmiðil) og 5% 15N ammóníumsúlfat (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) sem eina köfnunarefnisgjafa. Gerið var endurheimt með skilvindu og moskítóflugulirfurnar voru fóðraðar að vild þar til þær púpuðust. Bætið við fiskimjöli (0,5 mg á hverjar 300 lirfur) til að koma í veg fyrir dánartíðni á fjórða stigi. Aðeins kvenkyns voru síðan notaðar í mökunartilraunum með ómerktum karldýrum til að greina karlkynspróteinið sem fluttist við mökun.
4-6 daga gamlar 15N-merktar meyjur voru neyddar til að para sig við jafnaldra ómerkta meyjur. Árangursrík pörun var staðfest með því að greina pörunartappa undir flúrljómunarsmásjá. Við 3, 12 og 24 mínútur á mínútu voru gáttir 45-55 pöruðu kvendýra aðgreindir í 50 µl af ammoníumbíkarbónati stuðpúða (pH 7,8) og jafnblandaðir með pestli. Jafnvökvinn var skilvinduður og ofanfljótandi vökvinn blandaður við 50 µl af 0,1% RapiGest (186001860, Waters) í 50 mM ammoníumbíkarbónati. Ofanfljótandi vökvinn og kúlan úr hverju sýni voru fryst á þurrís og send yfir nótt til MacCoss rannsóknarstofunnar við Háskólann í Washington, þar sem undirbúningur sýna fyrir LC-MS/MS var lokið. Enduruppleyst kúlan í 50 µl af 0,1% RapiGest í 50 mM ammoníumbíkarbónati og hljóðbeitt í vatnsbaði. Próteinþéttni kúlunnar og ofanfljótandi vökvans var mæld með ... Í BCA prófun voru sýni afoxuð með 5 mM díþíóþreitóli (DTT; Sigma), alkýleruð með 15 mM joðasetamíði (Sigma) og ræktuð við 37°C (1:0:50) í 1 klukkustund með trypsíneringu: trypsín:hvarfefnishlutfall). RapiGest var leyst upp með því að bæta við 200 mM HCl, síðan ræktuð við 37°C í 45 mínútur og skilvindu við 14.000 snúninga á mínútu í 10 mínútur við 4°C til að fjarlægja leifar. Sýnin voru þvegin með tvískiptri fastfasa útdráttaraðferð (Oasis MCX rörlykjur, Waters) og enduruppleyst í 0,1% maurasýru fyrir lokapróteinþéttni upp á 0,33 µg µl-1. Ómerkt MAG prótein voru greind á sama hátt úr óreyndum körlum. Tvær greiningarendurtekningar voru greindar fyrir hvert sýni. Næst var 1 µg af hvoru greint með því að nota 25 cm sambrædda kísil 75 µm dálk með... 4 cm bræddur kísil Kasil1 (PQ) frittafella pakkað með Jupiter C12 öfugum fasa plastefni (Phenomenex) og 180 mínútna vökvaskiljun. Sýnisbrot – MS/MS var keyrt á Q-Exactive HF massagreini (Thermo Fisher) með nanoACQUITY UPLC kerfi (Waters). Gagnatengd öflunargögn sem mynduð voru fyrir hverja keyrslu voru breytt í mzML snið með því að nota Proteowizard (útgáfa 3.0.20287) og með því að nota Comet31 (útgáfa 3.2) gegn FASTA gagnagrunninum sem inniheldur próteinraðir frá Anopheles gambiae (VectorBase útgáfa 54), Anopheles coluzzi. Leit var gerð á Mali-NIH (VectorBase útgáfa 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, mars 2021), A. gambiae RNA-seq og þriggja ramma þýðingum á þekktum mengunarefnum úr mönnum. Peptíðkort-samsvöruð FDR voru ákvörðuð með því að nota Percolator32 (útgáfa 3.05) með þröskuldi 0,01, og peptíð voru sett saman í próteinauðkenningar með því að nota próteinsparnað í Limelight33 (útgáfa 2.2.0). Hlutfallslegt próteinmagn var áætlað með því að nota staðlaðan litrófsstuðul (NSAF) sem reiknaður var fyrir hvert prótein í hverri keyrslu eins og áður hefur verið lýst. Meðaltal NSAF miðað við hvert prótein var reiknað yfir sýni úr tveimur mismunandi líffræðilegum endurteknum prófum. 15N merking dulið kvenkyns próteinið með góðum árangri, þó að lítið magn af ómerktu próteini hafi mátt greina frá merktum meyjum. Við skráðum greiningu á minnkun karlkyns próteina (1-5 litróf) í hráum kvenkyns sýnum aðeins í tæknilegum keyrslum, þar sem hrá sýni voru keyrð eftir karlkyns/pörunarsýni, sem afleiðing af „flutningi“ með hágæðavökvaskiljun (HPLC). Einstaka prótein sem fundust sem „mengunarefni“ frá merktum meyjum eru talin upp í viðbótartöflu 1.
Tvö mótefnavaka peptíð, QTTDRVAPAPDQQQ (innan samsætu PA) og MESDGTTPSGDSEQ (innan samsætu PA og PB) í Genscript. Peptíðin tvö voru sameinuð, síðan tengd burðarpróteininu KLH og sprautuð í nýsjálenska kanínur. Kanínurnar voru aflífaðar eftir fjórðu inndælinguna og heildar IgG var einangrað með sæknihreinsun. IgG frá þeirri kanínu sem var sértækust fyrir EPP var notað til frekari western blotting.
Fyrir vesturblöt, MAG (n = 10, þar sem n táknar fjölda líffræðilega óháðra moskítóflugnasýna) og kvenkyns LRT (n = 30) úr 4 daga gömlum meyjum og meyjum eða nauðungarpöruðum kvenkyns moskítóflugum (<10 eftir pörun), var próteinútdráttarlausn (50 mM Tris, pH 8,0; 1% NP-40; 0,25% natríumdeoxýkólat; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× próteasahemill (Roche)) bætt við sérstaklega. Sýnin voru einsleit strax eftir að þeim var klippt með perlu (2 mm glerperlur, 2.400 snúningar á mínútu, 90 sekúndur). Óleysanlegt leifar var fjarlægt með skilvindu við 20.000 g við 4°C. Prótein voru magngreind með Bradford prófun (Bio-Rad). Síðan voru 20 µg af MAG próteini, 40 µg af LRT próteini og 20 µg af afgangspróteini afeitruð og aðskilin með 10% Bis-Tris NuPAGE með MOPS stuðpúða. Prótein voru flutt yfir á pólývínýliden flúoríð himnur með iBlot2 flutningskerfinu (Thermo Fisher). Himnurnar voru þvegnar tvisvar í 1× PBS-T (0,1% Tween-20 í PBS) og síðan blokkaðar í Odyssey blokkunarstuðpúða (Li-Cor) í 1 klukkustund við 22°C. Himnurnar voru hristar yfir nótt við 4°C með sérsniðnu kanínu mótefni gegn EPP fjölklóna frummótefni (1:700 í blokkunarstuðpúða) og rottu mótefni gegn aktín einklóna frummótefni MAC237 (Abeam; 1:4.000). Himnurnar voru þvegnar með PBS-T og síðan ræktaðar með auka mótefnum (asna mótefni gegn kanínu 800CW og geita mótefni gegn rottum 680LT (Li-Cor), bæði 1:20.000) í blokkunarstuðpúða sem innihélt 0,01% SDS og 0,2% Tween -20 í 1 klukkustund við 22. °C. Himnur voru þvegnar með PBS-T og myndir teknar með Odyssey CLx skanna. Myndir voru safnaðar og unnar í Image Studio (útgáfa 5.2). Sérstakt band sem samsvarar EPP-RA ísóforminu (82 kDa) greindist ekki.
Kóðunarsvæði EPP (sem ísóformið AGAP002463-RB sem inniheldur histidín fosfatasa lén, NCBI varðveitt lénsleit 34) og EcK2 (AGAP002181) voru klónuð í pET-21a(+) plasmíð (Novagen Millipore Sigma); Praimerar eru taldir upp í töflu 2 með ítarlegri gögnum. Átta GS4 tenglar (í röð) voru settir inn fyrir C-enda 6xHis merkið á pET-21a(+)-EcK2 smygildinu. Endurröðuð prótein voru framleidd með því að nota NEBExpress frumulausa E. coli próteinmyndunarviðbrögðin (New England BioLabs). Endurröðuð prótein voru hreinsuð með því að nota NEBExpress Ni spuna dálka (New England BioLabs). Díhýdrófólat redúktasa (DHFR) stjórnprótein var framleitt með því að nota DNA sniðmát úr NEBExpress frumulausu E. coli próteinmyndunarsettinu. Prótein voru geymd í 50% glýseróli í PBS við -20°C í allt að 3 mánuði.
Fosfatasavirkni EPP og vefjaútdráttar var mæld með 4-nítrófenýlfosfati (pNPP; Sigma-Aldrich). Hvarflausnin innihélt 25 mM Tris, 50 mM ediksýru, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA og 1 mM DTT. Vefur var jafngerður í hvarflausninni og frumuleifar fjarlægðar með skilvindu. Hefið hvarfið með því að bæta ensími eða vefjaútdrætti við hvarflausnina sem innihélt 2,5 mg ml-1 pNPP. Hvarfblandan var ræktuð við stofuhita í myrkri og magn pNP sem breytt var úr pNPP var magngreint með því að mæla gleypni við 405 nm á ýmsum tímum.
Til að auka EcK virkni in vitro var próteinið ræktað með 0,2 mg af 20E eða 3D20E í 200 µl af stuðpúða (pH 7,5) sem innihélt 10 mM HEPES-NaOH, 0,1% BSA, 2 mM ATP og 10 mM MgCl2 í 2 klst. við 27°C. Viðbrögðunum var hætt með því að bæta við 800 µl af metanóli, síðan kælt við -20°C í 1 klukkustund og síðan skilvindt við 20.000 g í 10 mínútur við 4°C. Yfirborðsvökvinn var síðan greindur með HPLC-MS/MS. Til að gera próteinin sem notuð voru í samanburðarhópnum óvirk með hita voru próteinin ræktuð í 50% glýseróli í PBS í 20 mínútur við 95°C.
Til að auka EPP virkni in vitro var próteinið ræktað með 3D20E22P (sem jafngildir magni þess sem finnst í 18 pörum af MAG, hreinsuðu með HPLC-MS/MS) í 100 µl af stuðpúða (pH 7,5) sem innihélt 25 mM Tris, 50 mM ediksýru, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA og 1 mM DTT í 3 klukkustundir við 27°C. Viðbrögðunum var hætt með því að bæta við 400 µl af metanóli og kælt við -20°C í 1 klukkustund og síðan skilvindt við 20.000 g í 10 mínútur við 4°C. Yfirborðsvökvinn var greindur með HPLC-MS/MS.
PCR-brot fyrir EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) og EcK2 (556 bp) voru magnað upp úr cDNA sem búið var til úr höfuðlausum moskítóflugum af blönduðum kynjum. PCR-brotið úr eGFP-viðmiðinu (495 bp) var magnað upp úr pCR2.1-eGFP sem áður hefur verið lýst; PCR-praimerar eru taldir upp í útvíkkaðri gagnatöflu 2. PCR-brotið var sett inn á milli öfugra T7-prómatanna á pL4440 plasmíði. Plasmíðbyggingar voru endurheimtar úr NEB 5-α hæfum E. coli (New England Biolabs) og staðfestar með DNA-raðgreiningu fyrir notkun (sjá viðbótargögn 1 fyrir innsetningarröð). Praimerar sem pöruðust við T7-prómatann (útvíkkaðar gagnatöflu 2) voru notaðir til að magna innsetninguna úr pL4440-byggða plasmíði. Stærð PCR-afurðarinnar var staðfest með agarósagel-rafdrætti. dsRNA var umritað úr PCR-sniðmátum með því að nota Megascript T7 umritunarbúnaðinn (Thermo Fisher) og hreinsað samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda með þeim breytingum sem áður hafa verið lýst.
Fyrir inndælingu á dsRNA voru 1.380 ng af dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) sprautað í styrk 10 ng nl-1 í brjósthol fullorðinna karla eða kvenna (Nanoject III, Drummond) innan eins dags eftir lokun gena. Niðurbrotsstig gena voru ákvörðuð í að minnsta kosti þremur líffræðilegum endurteknum tilraunum með RNA útdrætti, cDNA myndun og RT-qPCR. Fyrir inndælingu á ecdysone voru 4 daga gömlum meyjum eða 6 daga gömlum meyjum, blóðfóðruðum kvendýrum sprautuð með 0,13, 0,21 eða 0,63 µg af 20E eða 3D20E (Nanoject III, Drummond) í styrk 1,3, 2,1, talið í sömu röð, allt eftir tilraunahönnun, eða 6,3 ng nl-1. Sprautið 100 nl af 10% (rúmmál/rúmmál) etanóli í vatni; 100 nl af 3D20E22P í 10% etanóli (jafngildir 75% af magni sem finnst í tveimur MAG-sprautum). Mýflugur voru handahófskennt úthlutaðar í hópinn sem fékk sprautu.
Fyrir hrygningarprófanir voru þriggja daga gömul kvendýr fóðruð að vild með mannsblóði. Fjarlægðu hálffóðraðar eða ófóðraðar moskítóflugur. Eftir meðferð voru kvendýrin sett í aðskilda hrygningarbikara í fjórar nætur, að minnsta kosti 48 klukkustundum eftir blóðmáltíðina. Egg voru talin undir stereóp (Stemi 508, Zeiss); fyrir pöruð kvendýr voru egg sem klekktust út í lirfur talin frjó.
Í mökunartilraunum fengu kvendýrin að minnsta kosti tvo daga, allt eftir meðferð, til að þróa með sér mótstöðu gegn mökun, og karldýr af sama aldri voru síðan sett í sama búr. Tvær nætur síðar voru frjóvguðu blöðrurnar úr kvendýrunum krufnar og erfðaefni DNA losað með frystingu-þíðingu og hljóðbylgju í stuðpúða sem innihélt 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA og 25 mM NaCl (pH 8,2). Sýnin voru ræktuð með próteinasa K (0,86 µg µl-1) í 15 mínútur við 55°C, og síðan í 10 mínútur við 95°C. Óhreinsuð erfðaefnisblöndur voru þynntar 10-falt og greind með qPCR á Y-litningsröðum; praimerar eru taldir upp í töflu 2 með ítarlegri gögnum. Fjarvera Y-litningsraðar gefur til kynna enga mökun.
Fyrir endurpörunarprófanir voru kvendýr sem höfðu verið nauðungarpöruð skoðuð til að athuga hvort pörunartappar væru til staðar til að staðfesta pörunarstöðu og þau fengu tvo daga til að þróa með sér mótþróa gagnvart pörun án þess að karldýrin væru til staðar, eins og áður hefur verið lýst36. Karldýr sem báru erfðabreyttar DsRed sæðisfrumur voru síðan sett í búr kvendýranna. Tveimur nóttum síðar voru frjóvgunarblöðrurnar krufnar úr kvendýrunum og erfðaefni DNA var útbúið eins og lýst er hér að ofan og greint með qPCR fyrir DsRed erfðabreytta genið; forsendur eru taldar upp í töflu 2 í ítarlegri gögnum. Fjarvera DsRed erfðabreytta gensins benti til þess að engin endurpörun hefði átt sér stað.
3D20E var myndað eins og áður hefur verið lýst 37. Í stuttu máli voru 10 mg af 20E (Sigma-Aldrich) leyst upp í 10 ml af vatni og síðan voru 30 mg af platínusvartri (í duftformi, Sigma-Aldrich) bætt við. Varm straumi af O2 var stöðugt blásið inn í hvarfblönduna, sem var hrærð við stofuhita. Eftir 6 klukkustundir voru 30 ml af metanóli bætt við til að stöðva hvarfið. Blandan var skilvind til að fjarlægja hvataagnir. Yfirborðsvökvinn var gufaður upp í lofttæmi við stofuhita þar til hann þornar. Þurrkaða hvarfefnið var leyst upp í 10% etanóli og metanóli til inndælingar fyrir HPLC-MS/MS greiningu. Umbreytingarhlutfallið (frá 20E í 3D20E) var um það bil 97% (Mynd 4b) og MS litróf myndaðs 3D20E samsvaraði því sem fannst í pöruðum kvendýrum (Mynd 4c).
Skýringartextinn inniheldur nákvæmar upplýsingar um tölfræðilegu prófanirnar sem framkvæmdar voru. GraphPad (útgáfa 9.0) var notað til að framkvæma Fisher's Exact próf, Mantel-Cox próf og Student's t-próf. Cochran-Mantel-Haenszel próf voru framkvæmd með sérsniðnu R forskrift (fáanlegt á https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). Gagnadreifingin var prófuð til að meta eðlilegleika með Shapiro-Wilk prófinu með marktækniþröskuldi 0,05. Þegar gögnin stóðust ekki eðlilegleikaprófið var Mann-Whitney prófið framkvæmt. Lifunargögn voru greind með Mantel-Cox prófinu. DESeq2 pakkinn (útgáfa 1.28.1) var notaður til að framkvæma RNA-seq genagreiningu á mismunandi tjáningu. Lárétta strikið á grafinu táknar miðgildið. Marktæknigildi P = 0,05 var notað sem þröskuldur fyrir öll próf.
Nánari upplýsingar um rannsóknarsnið er að finna í útdrætti Nature Research Report sem tengist þessari grein.
Gögn um próteómfræði MS voru lögð inn í ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) í gegnum PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) með gagnasafnsauðkenninu PXD032157.
RNA-seq gagnasafninu er geymt í Gene Expression Comprehensive Library (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) undir raðnúmerinu GSE198665.
Hægt er að fá frekari gagnasöfn sem búin voru til og/eða greind í þessari rannsókn frá viðkomandi höfundum ef sanngjörn beiðni er lögð fram. Þessi grein veitir upprunagögnin.
De Loof, A. Ecdysteroids: Vanrækt kynhormón skordýra? Karlkyns: Black Box. Insect Science. 13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hýdroxýecdýsón og þroski eggjastokka í Anopheles stephens. J. Insect Physiology. 28, 97–109 (1982).