Ónæmisstýrandi umbrotsefni eru lykilatriði í æxlisörumhverfi (TME), en með fáeinum undantekningum er hverjir eru að mestu óþekktir. Hér greindum við æxli og T-frumur úr æxlum og kviðarholsvökva sjúklinga með hágráðu sermisæxli (HGSC) til að sýna fram á umbrotsefni þessara mismunandi TME-hólfa. Mikil munur er á umbrotsefnum kviðarholsfrumum og æxlisfrumum. Í samanburði við kviðarholsvökva eru æxlisíferandi T-frumur verulega auðgaðar af 1-metýlnikótínamíði (MNA). Þó að magn MNA í T-frumum sé hækkað, er tjáning nikótínamíðs N-metýltransferasa (ensím sem hvatar flutning metýlhópa frá S-adenosýlmetíóníni í nikótínamíð) takmörkuð við bandvefsfrumur og æxlisfrumur. Virknislega örvar MNA T-frumur til að seyta æxlisörvandi frumuboðefninu æxlisdrepsþáttur alfa. Þess vegna stuðlar TME-unnið MNA að ónæmisstjórnun T-frumna og er hugsanlegt ónæmismeðferðarmarkmið fyrir meðferð krabbameins hjá mönnum.
Umbrotsefni sem myndast við æxli geta haft djúpstæð hamlandi áhrif á ónæmi gegn æxli og fleiri og fleiri vísbendingar benda til þess að þau geti einnig þjónað sem lykilkraftur í framgangi sjúkdómsins (1). Auk Warburg-áhrifa hefur nýleg vinna hafist við að lýsa efnaskiptaástandi æxlisfrumna og tengslum þess við ónæmisástand æxlisörumhverfisins (TME). Rannsóknir á músamódelum og T-frumum úr mönnum hafa sýnt að glútamínumbrot (2), oxunarefnaskipti (3) og glúkósaefnaskipti (4) geta virkað sjálfstætt á ýmsa undirhópa ónæmisfrumna. Nokkur umbrotsefni í þessum ferlum hamla æxlishemjandi virkni T-frumna. Það hefur verið sannað að hindrun á kóensíminu tetrahýdróbíopteríni (BH4) getur skaðað fjölgun T-frumna og aukning BH4 í líkamanum getur aukið ónæmissvörun gegn æxli sem miðlað er af CD4 og CD8. Að auki er hægt að bjarga ónæmisbælandi áhrifum kynúreníns með gjöf BH4 (5). Í stökkbreyttu ísósítrat dehýdrógenasa (IDH) heilaæxli hamlar seyting enantiómetabólísks (R)-2-hýdroxýglútarats (R-2-HG) virkjun, fjölgun og frumusundrunarvirkni T-frumna (6). Nýlega hefur verið sýnt fram á að metýlglýoxal, aukaafurð glýkólýsu, er framleitt af bælifrumum af mergfrumuuppruna og flutningur metýlglýoxals í T-frumur getur hamlað virkni áhrifaríkra T-frumna. Í meðferð getur hlutleysing metýlglýoxals yfirbugað virkni mergfrumubælifrumu (MDSC) og samverkandi aukið meðferð við blokkun á eftirlitsstöðvum í músamódelum (7). Þessar rannsóknir leggja samanlagt áherslu á lykilhlutverk TME-afleiddra umbrotsefna í stjórnun á virkni og virkni T-frumna.
Víða hefur verið greint frá vanstarfsemi T-frumna í eggjastokkakrabbameini (8). Þetta er að hluta til vegna efnaskiptaeinkenna sem fylgja súrefnisskorti og óeðlilegum æðakerfi í æxli (9), sem leiðir til umbreytingar glúkósa og tryptófans í aukaafurðir eins og mjólkursýru og kynúrenín. Of mikið utanfrumulaktat dregur úr framleiðslu interferóns-γ (IFN-γ) og knýr áfram sérhæfingu mergbælandi undirhópa (10, 11). Neysla tryptófans hamlar beint fjölgun T-frumna og hamlar merkjasendingum frá T-frumuviðtökum (12-14). Þrátt fyrir þessar athuganir var mikil vinna unnin varðandi ónæmisefnaskipti í in vitro T-frumurækt með því að nota bjartsýni, eða takmörkuð við einsleit músamódel in vivo, en hvorugt þessara endurspeglar að fullu ólíkleika krabbameina hjá mönnum og lífeðlisfræðilegt stórt og ört umhverfi.
Algengt einkenni eggjastokkakrabbameins er útbreiðsla kviðarhols og tilkoma kviðarholsbólgu. Uppsöfnun frumuvökva í kviðarholsbólgu tengist langt gengnum sjúkdómi og slæmum horfum (15). Samkvæmt skýrslum er þetta einstaka hólf súrefnissnautt, hefur mikið magn af æðaþelsvaxtarþætti (VEGF) og indólamín 2,3-díoxýgenasa (IDO) og er síast inn af T-stýrifrumum og mergfrumuhömlun (15-18). Efnaskiptaumhverfi kviðarholsbólgu getur verið frábrugðið æxlinu sjálfu, þannig að endurforritun T-frumna í kviðarholsrýminu er óljós. Að auki getur lykilmunurinn og ólíkleiki milli kviðarholsbólgu og umbrotsefna sem eru til staðar í æxlisumhverfinu hindrað íferð ónæmisfrumna og virkni þeirra á æxli og frekari rannsókna er þörf.
Til að leysa þessi vandamál hönnuðum við næma frumuskiljunar- og vökvaskiljunar-tandem massagreiningaraðferð (LC-MS/MS) til að rannsaka mismunandi frumugerðir (þar á meðal CD4+ og CD8+ T frumur) sem og innan og á milli æxla. Umbrotsefni þess spanna frumur í sama kviðarholsvökva- og æxlisumhverfi sjúklingsins. Við notum þessa aðferð í tengslum við hávíddarflæðisfrumugreiningu og RNA-raðgreiningu á einum frumu (scRNA-seq) til að fá mjög skýra mynd af efnaskiptastöðu þessara lykilhópa. Þessi aðferð leiddi í ljós verulega aukningu á magni 1-metýlnikótínamíðs (MNA) í T-frumum æxla og tilraunir in vitro sýndu að ónæmisstýrandi áhrif MNA á starfsemi T-frumna voru áður óþekkt. Almennt séð leiðir þessi aðferð í ljós gagnkvæm efnaskiptasamspil milli æxla og ónæmisfrumna og veitir einstaka innsýn í umbrotsefni ónæmisstýringar, sem geta verið gagnleg við meðferð á ónæmismeðferð við eggjastokkakrabbameini sem byggir á T-frumum.
Við notuðum hávíddarflæðisfrumusjá til að mæla samtímis glúkósuupptöku [2-(N-(7-nítrófenýl-2-oxa-1,3-díasa-4-ýl)amínó)-2-deoxýglúkósi (2-NBDG) og hvatberavirkni [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) eru dæmigerð merki sem aðgreina ónæmisfrumur og æxlisfrumuþýði hlið við hlið (Tafla S2 og Mynd S1A). Þessi greining sýndi að samanborið við T-frumur hafa kviðarholsfrumur og æxlisfrumur hærri glúkósuupptöku en minni munur á hvatberavirkni. Meðal glúkósuupptaka æxlisfrumna [CD45-EpCAM (EpCAM)+] er þrisvar til fjórum sinnum meiri en hjá T-frumum og meðal glúkósuupptaka CD4+ T-frumna er 1,2 sinnum meiri en hjá CD8+ T-frumum, sem bendir til þess að æxlisíferandi eitilfrumur (TIL) hafi mismunandi efnaskiptaþarfir jafnvel í sama TME (Mynd 1A). Hins vegar er hvatberavirkni í æxlisfrumum svipuð og í CD4 + T frumum, og hvatberavirkni beggja frumugerða er hærri en í CD8 + T frumum (Mynd 1B). Almennt sýna þessar niðurstöður efnaskiptastig. Efnaskiptavirkni æxlisfrumna er hærri en í CD4 + T frumum, og efnaskiptavirkni CD4 + T frumna er hærri en í CD8 + T frumum. Þrátt fyrir þessi áhrif milli frumugerða er enginn samkvæmur munur á efnaskiptastöðu CD4 + og CD8 + T frumna eða hlutfallslegu hlutfalli þeirra í kviðarholsvökva samanborið við æxli (Mynd 1C). Hins vegar jókst hlutfall EpCAM+ frumna í æxlinu í CD45-frumuhlutanum samanborið við kviðarholsvökva (Mynd 1D). Við sáum einnig greinilegan efnaskiptamun á milli EpCAM+ og EpCAM- frumuþátta. EpCAM+ (æxlis) frumur hafa meiri glúkósaupptöku og hvatberavirkni en EpCAM- frumur, sem er mun hærri en efnaskiptavirkni bandvefsfruma í æxlisfrumum í TME (Mynd 1, E og F).
(A og B) Miðgildi flúrljómunarstyrks (MFI) glúkósuupptöku (2-NBDG) (A) og hvatberavirkni CD4 + T-frumna (MitoTracker dökkrauður) (B) Dæmigerðar línurit (vinstri) og töflugögn (hægri), CD8 + T-frumur og EpCAM + CD45-æxlisfrumur úr kviðarholsvökva og æxli. (C) Hlutfall CD4 + og CD8 + frumna (af CD3 + T-frumum) í kviðarholsvökva og æxli. (D) Hlutfall EpCAM + æxlisfrumna í kviðarholsvökva og æxli (CD45−). (E og F) EpCAM + CD45-æxli og EpCAM-CD45-fylki glúkósuupptaka (2-NBDG) (E) og hvatberavirkni (MitoTracker dökkrauður) (F) Dæmigerðar línurit (vinstri) og töflugögn (hægri) Kviðarholsfrumur og æxlisfrumur. (G) Dæmigerðar línurit af CD25, CD137 og PD1 tjáningu með flæðifrumusjá. (H og I) CD25, CD137 og PD1 tjáning á CD4 + T frumum (H) og CD8 + T frumum (I). (J og K) Óvirkar, miðlægar minnis- (Tcm), áhrifaminnis- (Teff) og áhrifaminnis- (Tem) svipgerðir byggðar á tjáningu CCR7 og CD45RO. Dæmigerðar myndir (vinstri) og töflugögn (hægri) af CD4 + T frumum (J) og CD8 + T frumum (K) í kviðarholsvökva og æxlum. P gildi ákvörðuð með paraðri t-prófi (*P<0,05, **P<0,01 og ***P<0,001). Línan táknar samsvarandi sjúklinga (n = 6). FMO, flúrljómun mínus einn; MFI, miðgildi flúrljómunarstyrks.
Frekari greining leiddi í ljós aðra marktæka mun á mjög greindri frumugerð T-frumna. Virkjað minni (mynd 1, G til I) og áhrifaminni (mynd 1, J og K) í æxlum eru mun algengari en kviðarholsvökvi (hlutfall CD3+ T-frumna). Á sama hátt sýndi greining á frumugerð með tjáningu virkjunarmerkja (CD25 og CD137) og eyðingarmerkja [forritað frumudauðaprótein 1 (PD1)] að þótt efnaskiptaeinkenni þessara hópa séu ólík (mynd S1, B til E), þá sást enginn marktækur efnaskiptamunur stöðugt milli óvirkra, áhrifavalda eða minnis undirhópa (mynd S1, F til I). Þessar niðurstöður voru staðfestar með því að nota vélanámsaðferðir til að úthluta sjálfkrafa frumugerðum (21), sem leiddi enn fremur í ljós tilvist mikils fjölda beinmergsfrumna (CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+) í kviðarholsvökva sjúklingsins (mynd S2A). Af öllum þeim frumugerðum sem greindar voru sýndi þessi mergfrumuhópur hæstu glúkósaupptöku og hvatberavirkni (mynd S2, B til G). Þessar niðurstöður undirstrika mikinn mun á efnaskiptum milli þeirra fjölmörgu frumugerða sem finnast í kviðarholsvökva og æxlum hjá sjúklingum með HGSC.
Helsta áskorunin við að skilja efnaskiptaeiginleika TIL er þörfin á að einangra T-frumusýni af nægilegum hreinleika, gæðum og magni úr æxlum. Nýlegar rannsóknir hafa sýnt að flokkunar- og perluauðgunaraðferðir byggðar á flæðifrumusjá geta leitt til breytinga á frumuefnaskiptaferlum (22-24). Til að vinna bug á þessu vandamáli fínstilltum við perluauðgunaraðferðina til að einangra og einangra TIL úr skurðaðgerðarskornum eggjastokkakrabbameini hjá mönnum fyrir greiningu með LC-MS/MS (sjá Efni og aðferðir; Mynd 2A). Til að meta heildaráhrif þessarar aðferðar á breytingar á efnaskiptaferlum bárum við saman efnaskiptaferla T-frumna sem virkjaðar voru af heilbrigðum gjöfum eftir ofangreint perluaðskilnaðarskref við frumur sem ekki voru perluaðskildar en héldust á ís. Þessi gæðaeftirlitsgreining leiddi í ljós að mikil fylgni er milli þessara tveggja aðstæðna (r = 0,77) og tæknileg endurtekningarhæfni hópsins af 86 efnaskiptaefnum hefur mikla endurtekningarhæfni (Mynd 2B). Þess vegna geta þessar aðferðir framkvæmt nákvæma greiningu á efnaskiptum í frumum sem gangast undir frumugerðarauðgun, og þannig veitt fyrsta háskerpuvettvanginn til að bera kennsl á tiltekna efnaskipti í HGSC, og þannig gert fólki kleift að öðlast dýpri skilning á frumusértækni kynefnaskiptaáætlunar.
(A) Skýringarmynd af segulperluauðgun. Fyrir greiningu með LC-MS/MS gangast frumurnar undir þrjár umferðir af segulperluauðgun í röð eða eru haldnar á ís. (B) Áhrif auðgunartegundar á magn umbrotsefna. Meðaltal þriggja mælinga fyrir hverja auðgunartegund ± staðalfrávik. Gráa línan táknar 1:1 samband. Innanflokksfylgni (ICC) endurtekinna mælinga sýnd á ásmerkinu. NAD, nikótínamíð adenín dínúkleótíð. (C) Skýringarmynd af vinnuflæði við greiningu umbrotsefna sjúklinga. Kviðarholsvökvi eða æxli eru tekin úr sjúklingum og fryst. Lítill hluti af hverju sýni var greindur með flæðifrumusjá, en hin sýnin gengust undir þrjár umferðir af auðgun fyrir CD4+, CD8+ og CD45- frumur. Þessir frumubrot voru greind með LC-MS/MS. (D) Hitakort af stöðluðu magni umbrotsefna. Dendrogrammið táknar Ward-þyrpingu á evklíðskum fjarlægðum milli sýna. (E) Aðalþáttagreining (PCA) á efnaskiptakorti sýnisins, sem sýnir þrjár endurtekningar af hverju sýni, sýni frá sama sjúklingi eru tengd með línu. (F) PCA efnaskiptaferils sýnisins, skilyrt fyrir sjúklinginn (þ.e. með því að nota hluta afritun); sýnisgerðin er takmörkuð af kúptum hjúp. PC1, aðalþáttur 1; PC2, aðalþáttur 2.
Næst notuðum við þessa auðgunaraðferð til að greina 99 umbrotsefni í CD4+, CD8+ og CD45-frumuhlutum í frumæxlum og æxlum sex sjúklinga með HGSC (Mynd 2C, Mynd S3A og Tafla S3 og S4). Þýðið sem um ræðir telur 2% til 70% af upprunalega stóra sýninu af lifandi frumum og hlutfall frumna er mjög mismunandi milli sjúklinga. Eftir að perlurnar hafa verið aðskildar telur auðgaða hlutfallið sem um ræðir (CD4+, CD8+ eða CD45-) að meðaltali meira en 85% af öllum lifandi frumum í sýninu. Þessi auðgunaraðferð gerir okkur kleift að greina frumustofna úr efnaskiptum í æxlisvef manna, sem er ómögulegt að gera úr stórum sýnum. Með þessari aðferð ákváðum við að l-kýnúrenín og adenósín, þessi tvö vel skilgreind ónæmisbælandi umbrotsefni, voru hækkuð í T-frumum eða æxlisfrumum í æxli (Mynd S3, B og C). Þess vegna sýna þessar niðurstöður fram á áreiðanleika og getu frumuaðskilnaðar- og massagreiningartækni okkar til að finna líffræðilega mikilvæg umbrotsefni í vefjum sjúklinga.
Greining okkar leiddi einnig í ljós sterkan efnaskiptamun á frumugerðum innan og milli sjúklinga (mynd 2D og mynd S4A). Sérstaklega sýndi sjúklingur 70 mismunandi efnaskiptaeinkenni samanborið við aðra sjúklinga (mynd 2E og mynd S4B), sem bendir til þess að verulegur efnaskiptamisræmi geti verið milli sjúklinga. Það er vert að taka fram að samanborið við aðra sjúklinga (1,2 til 2 lítrar; tafla S1) var heildarmagn kviðarholsvökva sem safnað var hjá sjúklingi 70 (80 ml) minna. Stjórnun á misræmi milli sjúklinga við aðalþáttagreiningu (til dæmis með því að nota hlutaafritunargreiningu) sýnir samræmdar breytingar á milli frumugerða og frumugerðirnar og/eða örumhverfið eru greinilega samanlögð samkvæmt efnaskiptaferlinum (mynd 2F). Greining einstakra efnaskiptaefna undirstrikaði þessi áhrif og leiddi í ljós marktækan mun á milli frumugerða og örumhverfis. Það er vert að taka fram að mesti munurinn sem sést er MNA, sem er venjulega auðgað í CD45- frumum og í CD4+ og CD8+ frumum sem síast inn í æxlið (mynd 3A). Fyrir CD4 + frumur eru þessi áhrif augljósust og MNA í CD8 + frumum virðist einnig vera undir miklum áhrifum frá umhverfinu. Þetta skiptir þó ekki máli þar sem aðeins þrír af sex sjúklingum geta metið CD8+ stig í æxlum. Auk MNA eru önnur umbrotsefni sem eru illa skilgreind í TIL einnig mismunandi rík af í mismunandi gerðum frumna í kviðarholsvökva og æxlum (myndir S3 og S4). Þess vegna sýna þessi gögn efnilegt safn ónæmisstýrandi umbrotsefna til frekari rannsókna.
(A) Stöðluð innihald MNA í CD4+, CD8+ og CD45- frumum úr kviðarholsvökva og æxli. Kassarit sýnir miðgildi (línu), millifjórðungsbil (rammalínu) og gagnabil, allt að 1,5 sinnum millifjórðungsbilið (rammavídd). Eins og lýst er í sjúklingagögnum og aðferðum, notið limma gildi sjúklingsins til að ákvarða P gildið (*P<0,05 og **P<0,01). (B) Skýringarmynd af efnaskiptum MNA (60). Umbrotsefni: S-adenosýl-1-metíónín; SAH, S-adenosín-1-hómósýstein; NA, nikótínamíð; MNA, 1-metýlnikótínamíð; 2-PY, 1-metýl-2-pýridón-5-karboxamíð; 4-PY, 1-metýl-4-pýridón-5-karboxamíð; NR, nikótínamíð ríbósi; NMN, nikótínamíð mónónúkleótíð. Ensím (grænt): NNMT, nikótínamíð N-metýltransferasi; SIRT, sirtuins; NAMPT, nikótínamíð fosfóríbósýl transferasi; AOX1, aldehýð oxídasi 1; NRK, nikótínamíð ríbósíð kínasi; NMNAT, nikótínamíð mónó Núkleótíð adenýlat transferasi; Pnp1, púrín núkleósíð fosfórýlasi. (C) t-SNE af scRNA-seq af kviðarholsvökva (grátt) og æxli (rautt; n = 3 sjúklingar). (D) NNMT tjáning í mismunandi frumuhópum greindar með scRNA-seq. (E) Tjáning NNMT og AOX1 í SK-OV-3, T-frumum úr fósturvísum nýrum úr mönnum (HEK) 293T, T-frumum og MNA-meðhöndluðum T-frumum. Felld tjáning er sýnd miðað við SK-OV-3. Tjáningarmynstrið með SEM er sýnt (n = 6 heilbrigðir gjafar). Ct gildi hærri en 35 eru talin ógreinanleg (UD). (F) Tjáning SLC22A1 og SLC22A2 í SK-OV-3, HEK293T, T-frumum og T-frumum sem meðhöndlaðar voru með 8mM MNA. Sýnd er felld tjáning miðað við SK-OV-3. Sýnt er tjáningarmynstur með SEM (n = 6 heilbrigðir gjafar). Ct gildi hærri en 35 eru talin ógreinanleg (UD). (G) Frumu-MNA innihald í virkjuðum heilbrigðum gjafa-T frumum eftir 72 klukkustunda ræktun með MNA. Sýnt er tjáningarmynstur með SEM (n = 4 heilbrigðir gjafar).
MNA er framleitt með því að flytja metýlhópinn úr S-adenosýl-1-metíóníni (SAM) yfir í nikótínamíð (NA) með nikótínamíð N-metýltransferasa (NNMT; Mynd 3B). NNMT er ofurtjáð í ýmsum krabbameinum hjá mönnum og tengist frumufjölgun, innrás og meinvarpi (25-27). Til að skilja betur uppruna MNA í T-frumum í TME notuðum við scRNA-seq til að lýsa tjáningu NNMT yfir frumugerðir í kviðarholsvökva og æxlum þriggja sjúklinga með HGSC (Tafla S5). Greining á um það bil 6.500 frumum sýndi að í kviðarholsvökva og æxlisumhverfi var NNMT tjáning takmörkuð við áætlaða bandvefsfrumu- og æxlisfrumuhópa (Mynd 3, C og D). Það er vert að taka fram að engin augljós NNMT tjáning er í neinum hópi sem tjáir PTPRC (CD45+) (Mynd 3D og Mynd S5A), sem bendir til þess að MNA sem greinist í umbrotsefnalitrófinu hafi verið kynnt í T-frumur. Tjáning aldehýðoxídasa 1 (AOX1) breytir MNA í 1-metýl-2-pýridón-5-karboxamíð (2-PYR) eða 1-metýl-4-pýridón-5-karboxamíð (4-PYR); mynd 3B) er einnig takmörkuð við þýði fibroblasta sem tjá COL1A1 (mynd S5A), sem samanlagt benda til þess að T-frumur skortir getu til hefðbundinna MNA-efnaskipta. Tjáningarmynstur þessara MNA-tengdu gena var staðfest með því að nota annað óháð frumugagnasafn úr kviðarholsvökva frá sjúklingum með HGSC (mynd S5B; n = 6) (16). Að auki sýndi megindleg PCR-greining (qPCR) á heilbrigðum gjafa-T-frumum sem meðhöndlaðar voru með MNA að samanborið við samanburðar SK-OV-3 eggjastokkaæxlisfrumur, var NNMT eða AOX1 næstum ekki tjáð (mynd 3E). Þessar óvæntu niðurstöður benda til þess að MNA gæti verið seytt frá fibroblastum eða æxlum í aðliggjandi T-frumur í TME.
Þó að mögulegir flutningsprótein innihaldi fjölskyldu lífrænna katjónaflutningspróteina 1 til 3 (OCT1, OCT2 og OCT3) sem eru kóðaðar af leysanlegu flutningspróteininu 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 og SLC22A3), eru möguleg flutningsprótein fyrir MNA enn óskilgreind (28). QPCR á mRNA úr heilbrigðum T-frumum úr gjafa sýndi lágt tjáningarstig SLC22A1 en ógreinanlegt magn SLC22A2, sem staðfesti að þetta hafði áður verið greint frá í fræðiritum (Mynd 3F) (29). Aftur á móti tjáði SK-OV-3 eggjastokkaæxlisfrumulínan hátt magn beggja flutningspróteina (Mynd 3F).
Til að kanna hvort T-frumur geti tekið upp erlent MNA voru heilbrigðar gjafa-T-frumur ræktaðar í 72 klukkustundir í mismunandi styrk MNA. Í fjarveru utanaðkomandi MNA er ekki hægt að greina frumuinnihald MNA (Mynd 3G). Hins vegar sýndu virkjaðar T-frumur sem meðhöndlaðar voru með utanaðkomandi MNA skammtaháða aukningu á MNA-innihaldi í frumunum, allt að 6 mM MNA (Mynd 3G). Þessi niðurstaða bendir til þess að þrátt fyrir lágt stig flutningspróteinstjáningar og skort á aðalensíminu sem ber ábyrgð á innanfrumuefnaskiptum MNA, getur TIL samt tekið upp MNA.
Litróf umbrotsefna í T-frumum sjúklinga og tilraunir með MNA frásog in vitro auka líkurnar á því að krabbameinstengdir bandvefsfrumur (CAF) seyti MNA og að æxlisfrumur geti stjórnað svipgerð og virkni TIL. Til að ákvarða áhrif MNA á T-frumur voru heilbrigðar gjafa-T-frumur virkjaðar in vitro með eða án MNA, og fjölgun þeirra og frumuboðefnaframleiðsla metin. Eftir 7 daga með því að bæta við MNA í hæsta skammti minnkaði tvöföldun stofnsins lítillega, en þrótturinn hélst við alla skammta (Mynd 4A). Að auki leiddi meðferð með utanaðkomandi MNA til aukningar á hlutfalli CD4 + og CD8 + T-frumna sem tjáðu æxlisdrepsþátt-α (TNFα; Mynd 4B). Aftur á móti minnkaði innanfrumuframleiðsla IFN-γ marktækt í CD4 + T-frumum, en ekki í CD8 + T-frumum, og engin marktæk breyting varð á interleukin 2 (IL-2; Mynd 4, C og D). Þess vegna sýndi ensímtengd ónæmisbælandi prófun (ELISA) á ofanvökva úr þessum MNA-meðhöndluðu T-frumuræktunum marktæka aukningu á TNFα, lækkun á IFN-γ og enga breytingu á IL-2 (Mynd 4, E til G). Lækkun IFN-γ bendir til þess að MNA gæti gegnt hlutverki í að hindra æxlishemjandi virkni T-frumna. Til að herma eftir áhrifum MNA á frumueiturverkanir sem miða á T-frumur eru kímærískir mótefnavaka T (FRα-CAR-T) frumur sem miða á fólatviðtaka α og CAR-T (GFP) sem stjórnast af grænu flúrljómandi prótein (GFP) -CAR-T frumum framleiddar af heilbrigðum útlægum blóðfrumum (PBMC) gjafa. CAR-T frumur voru ræktaðar í 24 klukkustundir í viðurvist MNA og síðan ræktaðar samhliða SK-OV-3 eggjastokkaæxlisfrumum úr mönnum sem tjá fólatviðtaka α í hlutfalli milli áhrifavalda og markhóps upp á 10:1. MNA meðferð leiddi til marktækrar minnkunar á drepandi virkni FRα-CAR-T frumna, sem var svipuð og FRα-CAR-T frumna sem meðhöndlaðar voru með adenosíni (mynd 4H).
(A) Heildarfjöldi lífvænlegra frumna og tvöföldun stofns (PD) beint úr ræktun á 7. degi. Súluritið sýnir meðaltal + staðalfrávik sex heilbrigðra gjafa. Táknar gögn úr að minnsta kosti n = 3 óháðum tilraunum. (B til D) CD3/CD28 og IL-2 voru notuð til að virkja T frumur við viðkomandi MNA styrk í 7 daga. Fyrir greiningu voru frumur örvaðar með PMA/jónómýsíni með GolgiStop í 4 klukkustundir. TNFα (B) tjáning í T frumum. Dæmimynd (vinstri) og töflugögn (hægri) af TNFα tjáningu í lifandi frumum. IFN-γ (C) og IL-2 (D) tjáning í T frumum. Tjáning frumuboða var mæld með flæðifrumusjá. Súluritið sýnir meðaltal (n = 6 heilbrigðir gjafar) + staðalfrávik. Notið einstefnu dreifingargreiningu og endurteknar mælingar (*P<0,05 og **P<0,01) til að ákvarða P gildi. Táknar gögn úr að minnsta kosti n = 3 óháðum tilraunum. (E til G) CD3/CD28 og IL-2 voru notuð til að virkja T frumur við viðkomandi MNA styrk í 7 daga. Miðillinn var safnað fyrir og eftir 4 klukkustunda PMA/jónómýsín örvun. Styrkur TNFα (E), IFN-γ (F) og IL-2 (G) var mældur með ELISA. Súluritið sýnir meðaltal (n = 5 heilbrigðir gjafar) + SEM. P gildi ákvarðað með einhliða dreifnigreiningu og endurteknum mælingum (*P < 0,05). Punktalínan gefur til kynna greiningarmörk greiningarinnar. (H) Frumulýsupróf. FRα-CAR-T eða GFP-CAR-T frumur voru stilltar með adenosíni (250 μM) eða MNA (10 mM) í 24 klukkustundir, eða látnar vera ómeðhöndlaðar (Ctrl). Prósenta SK-OV-3 frumudráps var mæld. P gildi ákvarðað með Welch t prófi (*P < 0,5 og **P < 0,01).
Til að öðlast skilning á MNA-háðri TNFα tjáningarstjórnun voru breytingar á TNFα mRNA í MNA-meðhöndluðum T-frumum metnar (Mynd 5A). Heilbrigðar gjafa-T-frumur sem meðhöndlaðar voru með MNA sýndu tvöfalda aukningu á TNFα umritunarstigi, sem bendir til þess að MNA sé háð TNFα umritunarstjórnun. Til að rannsaka þennan mögulega stjórnunarferli voru tveir þekktir umritunarþættir sem stjórna TNFα, þ.e. virkjaður T-frumukjarnaþáttur (NFAT) og sértækt prótein 1 (Sp1), metnir sem svar við MNA bindingu við nærliggjandi TNFα hvata (30). TNFα hvatinn inniheldur 6 greindar NFAT bindistaði og 2 Sp1 bindistaði, sem skarast á einum stað [-55 basapör (bp) frá 5'-lokinu] (30). Krómatín ónæmisútfelling (ChIP) sýndi að þegar MNA var meðhöndlað þrefaldaðist binding Sp1 við TNFα hvata. Innlimun NFAT jókst einnig og varð mikilvægari (Mynd 5B). Þessar upplýsingar benda til þess að MNA stjórni tjáningu TNFα í gegnum Sp1 umritun, og í minna mæli tjáningu NFAT.
(A) Í samanburði við T-frumur ræktaðar án MNA, breytist tjáning TNFα í T-frumum sem meðhöndlaðar voru með MNA margfalt. Tjáningarmynstrið með SEM er sýnt (n = 5 heilbrigðir gjafar). Táknar gögn úr að minnsta kosti n = 3 óháðum tilraunum. (B) TNFα hvati T-frumna sem meðhöndlaðar voru með eða án 8 mM MNA eftir að NFAT og Sp1 voru sameinuð með (Ctrl) og PMA/jónómýsín örvun í 4 klukkustundir. Ónæmisglóbúlín G (IgG) og H3 voru notuð sem neikvæð og jákvæð samanburðarhópur fyrir ónæmisútfellingu, talið í sömu röð. Magnbundin ákvörðun ChIP sýndi að binding Sp1 og NFAT við TNFα hvata í MNA-meðhöndluðum frumum jókst nokkrum sinnum samanborið við samanburðarhópinn. Táknar gögn úr að minnsta kosti n = 3 óháðum tilraunum. P gildi ákvarðað með mörgum t-prófum (*** P <0,01). (C) Í samanburði við kviðarholsvökva HGSC sýndu T-frumur (ekki frumudrepandi) aukna tjáningu TNF í æxlinu. Litirnir tákna mismunandi sjúklinga. Sýndu frumurnar hafa verið valdar af handahófi í 300 og titraðar til að takmarka ofdrátt (** Padj = 0,0076). (D) Tillögur að líkani af MNA fyrir eggjastokkakrabbamein. MNA er framleitt í æxlisfrumum og bandvefsfrumum í TME og er tekið upp af T-frumum. MNA eykur bindingu Sp1 við TNFα hvata, sem leiðir til aukinnar TNFα umritunar og TNFα frumuboðefnaframleiðslu. MNA veldur einnig lækkun á IFN-γ. Hömlun á starfsemi T-frumna leiðir til minnkaðrar drepandi getu og hraðari æxlisvaxtar.
Samkvæmt skýrslum hefur TNFα bæði æxlishemjandi og æxlishemjandi áhrif bæði að framan og aftan, en það gegnir vel þekktu hlutverki í að stuðla að vexti og meinvarpi eggjastokkakrabbameins (31-33). Samkvæmt skýrslum er styrkur TNFα í kviðarholsvökva og æxlisvef hjá sjúklingum með eggjastokkakrabbamein hærri en í góðkynja vefjum (34-36). Hvað varðar verkunarháttur getur TNFα stjórnað virkjun, virkni og fjölgun hvítra blóðkorna og breytt svipgerð krabbameinsfrumna (37, 38). Í samræmi við þessar niðurstöður sýndi greining á mismunadreifingu genatjáningar að TNF var marktækt aukið í T-frumum í æxlisvef samanborið við kviðarholsvökva (Mynd 5C). Aukning á TNF tjáningu var aðeins augljós í T-frumuþýðum með frumueyðandi svipgerð (Mynd S5A). Í stuttu máli styðja þessi gögn þá skoðun að MNA hafi tvöföld ónæmisbælandi og æxlisörvandi áhrif í HGSC.
Flúrljómandi merking byggð á flæðifrumusjá hefur orðið aðalaðferðin til að rannsaka efnaskipti TIL. Þessar rannsóknir hafa sýnt að samanborið við eitilfrumur í útlægum blóði eða T-frumur úr annars stigs eitlum, hafa músa- og manna-TIL meiri tilhneigingu til að taka upp glúkósa (4, 39) og smám saman tap á starfsemi hvatbera (19, 40). Þó að við höfum séð svipaðar niðurstöður í þessari rannsókn, er lykilþróunin að bera saman efnaskipti æxlisfrumna og TIL úr sama skurðaða æxlisvef. Í samræmi við sumar af þessum fyrri skýrslum hafa æxlisfrumur (CD45-EpCAM +) úr kviðarholsvökva og æxlum meiri glúkósaupptöku en CD8 + og CD4 + T-frumur, sem styður að hægt sé að bera saman mikla glúkósaupptöku æxlisfrumna við T-frumur. Hugtakið um samkeppni T-frumna. TME. Hins vegar er hvatberavirkni æxlisfrumna meiri en CD8 + T-frumna, en hvatberavirkni er svipuð og hjá CD4 + T-frumum. Þessar niðurstöður styrkja vaxandi þemað um að oxunarefnaskipti séu mikilvæg fyrir æxlisfrumur (41, 42). Þeir benda einnig til þess að CD8 + T frumur gætu verið viðkvæmari fyrir oxunartruflunum en CD4 + T frumur, eða að CD4 + T frumur gætu notað aðrar kolefnisgjafa en glúkósa til að viðhalda hvatberavirkni (43, 44). Taka skal fram að við sáum engan mun á glúkósaupptöku eða hvatberavirkni milli CD4 + T áhrifafrumna, T áhrifaminnisfrumna og T miðlægra minnisfrumna í kviðarholsvökva. Á sama hátt hefur sérhæfingarstaða CD8 + T frumna í æxlum ekkert að gera með breytingar á glúkósaupptöku, sem undirstrikar verulegan mun á T frumum ræktuðum in vitro og manna TIL in vivo (22). Þessar athuganir voru einnig staðfestar með notkun óhlutdrægrar sjálfvirkrar frumuhópaúthlutunar, sem leiddi enn fremur í ljós að CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + frumur með meiri glúkósaupptöku og hvatberavirkni en æxlisfrumur eru algengar en hafa efnaskiptavirka frumuhópa. Þessi hópur gæti táknað hugsanlegan undirhóp mergfrumnabælandi frumna eða plasmafrumutannfrumur sem greindar voru í scRNA-seq greiningunni. Þó að bæði þessi einkenni hafi verið skráð í eggjastokkaæxlum hjá mönnum [45], þarf enn frekari vinnu til að lýsa þessum undirhópi mergfrumna.
Þó að aðferðir sem byggja á flæðifrumusjá geti skýrt almennan mun á glúkósa- og oxunarefnaskiptum milli frumugerða, hefur nákvæm umbrotsefni sem framleidd eru af glúkósa eða öðrum kolefnisgjöfum fyrir umbrot í hvatberum í TME ekki enn verið ákvörðuð. Að úthluta nærveru eða fjarveru umbrotsefna til tiltekins TIL undirhóps krefst hreinsunar á frumustofninum úr útskornum vef. Þess vegna getur frumuauðgunaraðferð okkar, ásamt massagreiningu, veitt innsýn í umbrotsefnin sem eru mismunandi auðguð í T-frumum og æxlisfrumustofnum í samsvarandi sjúklingasýnum. Þó að þessi aðferð hafi kosti umfram flúrljómunarvirkjaða frumuflokkun, geta ákveðin umbrotsefnasöfn orðið fyrir áhrifum vegna eðlislægs stöðugleika og/eða hraðs endurnýjunarhraða (22). Engu að síður gat aðferð okkar greint tvö þekkt ónæmisbælandi umbrotsefni, adenosín og kynúrenín, þar sem þau eru mjög mismunandi milli sýnagerða.
Metabonomísk greining okkar á æxlum og undirgerðum TIL veitir meiri innsýn í hlutverk umbrotsefna í TME í eggjastokkum. Í fyrsta lagi, með því að nota flæðifrumusjá, komumst við að því að enginn munur var á virkni hvatbera milli æxla og CD4 + T-frumna. Hins vegar leiddi LC-MS/MS greining í ljós verulegar breytingar á magni umbrotsefna hjá þessum hópum, sem bendir til þess að niðurstöður um efnaskipti TIL og heildar efnaskiptavirkni þess krefjist vandlegrar túlkunar. Í öðru lagi er MNA umbrotsefnið með mestan mun á CD45-frumum og T-frumum í kviðarholsvökva, ekki æxlum. Þess vegna getur hólfaskipting og staðsetning æxla haft mismunandi áhrif á efnaskipti TIL, sem undirstrikar mögulega ólíkleika í tilteknu örumhverfi. Í þriðja lagi er tjáning MNA-framleiðandi ensímsins NNMT aðallega takmörkuð við CAF, sem eru æxlisfrumur í minna mæli, en greinanleg MNA gildi sjást í T-frumum sem eru ættleiddar af æxli. Ofurtjáning NNMT í CAF í eggjastokkum hefur þekkt krabbameinsörvandi áhrif, að hluta til vegna þess að það stuðlar að efnaskiptum CAF, innrás æxla og meinvarpa (27). Þó að heildarmagn TIL sé miðlungs, þá er tjáning NNMT í CAF nátengd mesenchymal undirgerðinni í Cancer Genome Atlas (TCGA), sem tengist slæmum horfum (27, 46, 47). Að lokum er tjáning ensímsins AOX1, sem ber ábyrgð á niðurbroti MNA, einnig takmörkuð við CAF þýðið, sem bendir til þess að T frumur skorti getu til að umbrotna MNA. Þessar niðurstöður styðja þá hugmynd að þótt frekari rannsókna sé þörf til að staðfesta þessa niðurstöðu, geti hátt magn MNA í T frumum bent til nærveru ónæmisbælandi CAF örumhverfis.
Í ljósi lágs tjáningarstigs MNA flutningspróteina og ógreinanlegs magns lykilpróteina sem taka þátt í efnaskiptum MNA, er tilvist MNA í T-frumum óvænt. Hvorki NNMT né AOX1 var hægt að greina með scRNA-seq greiningu og markvissri qPCR á tveimur óháðum hópum. Þessar niðurstöður benda til þess að MNA sé ekki myndað af T-frumum, heldur frásogað úr nærliggjandi TME. In vitro tilraunir sýna að T-frumur hafa tilhneigingu til að safna utanaðkomandi MNA.
Rannsóknir okkar in vitro hafa sýnt að utanaðkomandi MNA örvar tjáningu TNFα í T-frumum og eykur bindingu Sp1 við TNFα hvata. Þó að TNFα hafi bæði æxlishemjandi og æxlishemjandi virkni, getur TNFα í eggjastokkakrabbameini stuðlað að vexti eggjastokkakrabbameins (31-33). Hlutleysing TNFα í eggjastokkakrabbameinsfrumuræktun eða útrýming TNFα merkis í músamódelum getur bætt framleiðslu TNFα-miðlaðrar bólguvaldandi frumuboða og hamlað æxlisvexti (32, 35). Þess vegna getur TME-afleitt MNA í þessu tilfelli virkað sem bólguvaldandi umbrotsefni í gegnum TNFα-háðan verkunarhátt í gegnum sjálfsofnæmislykkjuna og þannig stuðlað að tilurð og útbreiðslu eggjastokkakrabbameins (31). Byggt á þessum möguleika er verið að rannsaka TNFα-blokkun sem hugsanlegt meðferðarefni við eggjastokkakrabbameini (37, 48, 49). Að auki hefur MNA áhrif á frumudrepandi áhrif CAR-T frumna á eggjastokkakrabbameinsfrumur, sem veitir frekari vísbendingar um MNA-miðlaða ónæmisbælingu. Þessar niðurstöður benda samanlagt til líkans þar sem æxli og CAF frumur seyta MNA í utanfrumu TME. Með (i) örvun á vexti eggjastokkakrabbameins af völdum TNF og (ii) hömlun á frumudrepandi virkni T frumna af völdum MNA, gæti þetta haft tvöföld áhrif á æxlið (mynd 5D).
Að lokum má segja að með því að beita blöndu af hraðri frumuauðgun, raðgreiningu einstakra frumna og efnaskiptagreiningu, leiddi þessi rannsókn í ljós mikinn mun á ónæmis- og efnaskiptaferlum milli æxla og kviðarholsfrumna hjá sjúklingum með háan krabbameinsígræðslu (HGSC). Þessi ítarlega greining sýndi að munur er á glúkósaupptöku og hvatberavirkni milli T-frumna og benti á MNA sem sjálfstæðan ónæmisstýrandi umbrotsefni sem ekki er frumugróf. Þessi gögn hafa áhrif á hvernig TME hefur áhrif á efnaskipti T-frumna í krabbameinum hjá mönnum. Þó að beinn samkeppni um næringarefni milli T-frumna og krabbameinsfrumna hafi verið greint frá, geta umbrotsefni einnig virkað sem óbein stjórnunarefni til að stuðla að æxlisvexti og hugsanlega bæla niður innrænt ónæmissvörun. Nánari lýsing á virkni þessara stjórnunarumbrotsefna gæti opnað fyrir aðrar aðferðir til að auka ónæmissvörun gegn æxli.
Sýni sjúklinga og klínísk gögn voru fengin í gegnum vefjageymslu krabbameinsæxla í Bresku Kólumbíu, sem er vottað af Kanadísku vefjageymslunetinu. Samkvæmt samskiptareglum sem samþykktar voru af siðanefnd krabbameinsrannsókna í Bresku Kólumbíu og Háskólanum í Bresku Kólumbíu (H07-00463), fengu öll sýni og klínísk gögn sjúklinga upplýst skriflegt samþykki eða höfðu afsalað sér formlega samþykki. Sýnin eru geymd í vottaða lífefnabankanum (BRC-00290). Ítarleg einkenni sjúklinga eru sýnd í töflum S1 og S5. Til frystingar er notaður skalpellur til að brjóta niður æxlissýni sjúklingsins vélrænt og síðan þrýsta því í gegnum 100 míkron síu til að fá eina frumulausn. Kviðarholsvökvi sjúklingsins var skilvinduður við 1500 snúninga á mínútu í 10 mínútur við 4°C til að mynda köggla af frumunum og fjarlægja ofanfljótandi vökva. Frumur úr æxlum og kviðarholsvökva voru frystar í 50% hitaóvirkjuðu AB sermi úr mönnum (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) og 10% dímetýlsúlfoxíði. Þessar varðveittu einstöku frumusviflausnir voru þiðnaðar og notaðar til efnaskipta- og umbrotsgreiningar eins og lýst er hér að neðan.
Heildarvökvinn samanstendur af 0,22 μm síuðu 50:50 viðbót af RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glútamíni (Thermo Fisher Scientific) bætt við 10% hitaóvirkjuðu AB sermi úr mönnum (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glútamíni (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific), 1 x Penicillin Streptomycin (PenStrep) lausn (Thermo Fisher Scientific) og 50 μMB-merkaptoetanóli. AimV (Invitrogen) er bætt við með 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) og 2 mM l-glútamíni (Thermo Fisher Scientific). Litunarstuðpúðinn fyrir flæðisfrumusjá samanstóð af 0,22 μm síuðu fosfatstuðpúðaðri saltlausn (PBS; Invitrogen) bætt við 3% hitaóvirkjuðu AB sermi úr mönnum (Sigma). Frumuauðgunarbufferinn er úr 0,22 μm síuðu PBS og bætt við 0,5% hitaóvirkjuðu AB sermi úr mönnum (Sigma-Aldrich).
Í 37°C heitu ræktunarvökva voru frumurnar litaðar með 10 nM MT DR og 100 μM 2-NBDG í 30 mínútur. Næst voru frumurnar litaðar með lífvænleikalitarefninu eF506 við 4°C í 15 mínútur. Enduruppleysið frumurnar í FC Block (eBioscience) og Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), þynnið í flæðifrumusjárlitunarlausn (samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda) og ræktið í 10 mínútur við stofuhita. Litið frumurnar með setti af mótefnum (Tafla S2) í flæðifrumusjárlitunarlausn við 4°C í 20 mínútur. Enduruppleysið frumurnar í flæðifrumusjárlitunarlausn (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R stillingu) fyrir greiningu. Notið SpectroFlo og FlowJo V10 til að greina frumutalningargögn og notið GraphPad Prism 8 til að búa til gögnin. Miðgildi flúrljómunarstyrks (MFI) 2-NBDG og MT DR var lógaritmískt staðlað og síðan var parað t-próf ​​notað til tölfræðilegrar greiningar til að taka tillit til samsvarandi sjúklinga. Fjarlægið alla þýði með færri en 40 tilvik úr greiningunni; færið inn MFI gildi 1 fyrir öll neikvæð gildi áður en tölfræðileg greining og gagnasýnileiki er framkvæmd.
Til að bæta við handvirka hliðunaraðferðina í ofangreindu ferli, notuðum við fulla skýringu frá formtakmörkunartrénu (FAUST) (21) til að úthluta frumum sjálfkrafa í þýðið eftir að dauðum frumum hefur verið eytt í FlowJo. Við stjórnum úttakinu handvirkt til að sameina þýði sem virðast vera rangt úthlutað (með því að sameina PD1+ við PD1-æxlisfrumur) og varðveittum þýðum. Hvert sýni inniheldur að meðaltali meira en 2% frumna, samtals 11 þýði.
Ficoll-þéttleikaskiljun með stigli var notuð til að aðskilja PBMC frá hvítfrumnaaðskilnaðarafurðum (STEMCELL Technologies). CD8+ T-frumur voru einangraðar úr PBMC með CD8 MicroBeads (Miltenyi) og þróaðar í heilum miðli með TransAct (Miltenyi) í 2 vikur samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Frumunum var leyft að standa í 5 daga í heilum miðli sem innihélt IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) og síðan örvað aftur með TransAct. Á 7. degi, samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda, voru manna CD45 MicroBeads (Miltenyi) notaðar til að auðga frumur í þremur lotum í röð. Frumurnar voru skipt í skömmtum fyrir flæðifrumugreiningu (eins og lýst er hér að ofan) og einni milljón frumna var skipt í skömmtum þrisvar sinnum fyrir LC-MS/MS greiningu. Sýnin voru unnin með LC-MS/MS eins og lýst er hér að neðan. Við áætluðum gildi vantandi umbrotsefna með jónafjölda upp á 1.000. Hvert sýni er staðlað með heildarjónafjölda (TIC), lógaritmískt umreiknað og sjálfkrafa staðlað í MetaboAnalystR fyrir greiningu.
Frumulausn hvers sjúklings var þiðin og síuð í gegnum 40 μm síu í heilan miðil (eins og lýst er hér að ofan). Samkvæmt verklagsreglum framleiðanda voru þrjár umferðir af jákvæðri valmynd með segulkornaaðskilnaði með MicroBeads (Miltenyi) notaðar til að auðga sýnin fyrir CD8+, CD4+ og CD45- frumur (á ís). Í stuttu máli eru frumurnar enduruppleystar í frumuauðgunarlausn (eins og lýst er hér að ofan) og taldar. Frumurnar voru ræktaðar með manna CD8 perlum, manna CD4 perlum eða manna CD45 perlum (Miltenyi) við 4°C í 15 mínútur og síðan þvegnar með frumuauðgunarlausn. Sýnið er látið renna í gegnum LS dálkinn (Miltenyi) og jákvæðu og neikvæðu brotin eru safnað saman. Til að stytta tímann og hámarka frumuendurheimt er CD8-brotið síðan notað fyrir aðra umferð CD4+ auðgunar og CD4-brotið er notað fyrir síðari CD45-auðgun. Geymið lausnina á ís allan tímann sem aðskilnaðurinn stendur yfir.
Til að undirbúa sýni fyrir greiningu á efnaskiptum voru frumurnar þvegnar einu sinni með ískaldri saltlausn og 1 ml af 80% metanóli var bætt við hvert sýni, síðan hrist með vortex og snöggfryst í fljótandi köfnunarefni. Sýnin voru fryst og þíð þrisvar sinnum og skilvind við 14.000 snúninga á mínútu í 15 mínútur við 4°C. Ofanvökvinn sem inniheldur efnaskiptin er gufaður upp þar til hann er þurr. Efnaskiptin voru leyst upp aftur í 50 μl af 0,03% maurasýru, hrist með vortex til að blanda og síðan skilvind til að fjarlægja óhreinindi.
Dragið út umbrotsefni eins og lýst er hér að ofan. Færið ofanfljótandi vökva í flösku með háafköstum vökvaskiljunarflösku fyrir rannsóknir á umbrotsefnum. Notið handahófskennda meðferðaraðferð til að meðhöndla hvert sýni með svipuðum fjölda frumna til að koma í veg fyrir lotuáhrif. Við framkvæmdum eigindlegt mat á heildarumbrotsefnum sem áður hafði verið birt á AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50). Litskiljunargreining og samþætting tindflatarmáls var framkvæmd með MultiQuant útgáfu 2.1 hugbúnaði (Applied Biosystems SCIEX).
Jónafjöldi upp á 1000 var notaður til að áætla gildi vantandi umbrotsefna og TIC hvers sýnis var notaður til að reikna út staðlað toppflatarmál hvers greindra umbrotsefnis til að leiðrétta fyrir breytingar sem komu fram við tækjagreiningu frá sýnisvinnslu. Eftir að TIC hefur verið staðlað er MetaboAnalystR(51) (sjálfgefin breyta) notuð fyrir lógaritmíska umbreytingu og sjálfvirka normlínukvarða. Við notuðum PCA með vegan R pakkanum til að framkvæma könnunargreiningu á mismun á umbrotsefnum milli sýnategunda og notuðum hlutaafritunargreiningu til að greina sjúklinga. Við notuðum Ward aðferðina til að smíða hitakorts dendrogram til að flokka evklíðska fjarlægðina milli sýna. Við notuðum limma (52) á stöðluðu umbrotsefnamagni til að bera kennsl á mismunandi magn umbrotsefna yfir alla frumugerðina og örumhverfið. Til að einfalda útskýringuna notum við hópmeðaltalsbreytuna til að tilgreina líkanið og lítum á frumugerðirnar í örumhverfinu sem hvern hóp (n = 6 hópar); Fyrir marktækniprófið framkvæmdum við þrjár endurteknar mælingar fyrir hvert umbrotsefni. Til að forðast falska afritun var sjúklingurinn tekinn með sem hindrun í limma-hönnuninni. Til að kanna muninn á umbrotsefnum milli mismunandi sjúklinga leiðréttum við limma-líkanið þannig að sjúklingar væru með á fastan hátt. Við birtum marktækni fyrirfram skilgreinds andstæðu milli frumugerðar og örumhverfis Padj <0,05 (Benjamini-Hochberg leiðrétting).
Eftir að lífskraftur var auðgaður með Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% lífvænleiki) var framkvæmd raðgreining á einstökum frumumati á heildarfrystum lifandi kviðarholsvökva- og æxlissýnum með 10x 5′ genatjáningaraðferð. Fimm tilfelli með samsvarandi æxlum og kviðarholsvökva voru greind, þó að lág lífvænleiki úr einu æxlissýni kom í veg fyrir að það væri tekið með. Til að ná fram margvíslegri vali á sjúklingum sameindum við sýni frá hverjum sjúklingi í brautum 10x krómstýringarinnar og greindum kviðarholsvökvann og æxlisstaði sérstaklega. Eftir raðgreiningu [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp pöruð endi (PE), erfðamengi Quebec; að meðaltali 73.488 og 41.378 lestur á hverja frumu fyrir æxli og kviðarholsvökva, talið í sömu röð]], notuðum við CellSNP og Vireo (53) (byggt á CellSNP sem Algengur SNP manna (VCF) sem GRCh38 veitir er úthlutað gjafaauðkenni. Við notum SNPRelate til að álykta um nánustu auðkenni (IBS) erfðagerðarstöðu sjúklingsins (IBS), að undanskildum óúthlutaðum frumum og frumum sem greindar eru sem tvíhliða og samsvarandi gjöfum milli kviðarhols- og æxlissýna (54). Á grundvelli þessa verkefnis héldum við eftir þremur tilfellum með mikilli frumufjölgun í æxli og kviðarholsvökva fyrir greiningu eftir niðurstreymi. Eftir að hafa framkvæmt fjöldasíun í scater (55) og scran (56) BioConductor pökkun, skilaði þetta 6975 frumum (2792 og 4183 frumum úr æxli og kviðarholsvökva, talið í sömu röð) til greiningar. Við notum Louvain þyrpingu igraph (57) á sameiginlegu nágrannaneti (SNN) byggt á fjarlægð Jaccard til þyrpingarfrumna eftir tjáningu. Klasar voru handvirkt merktir við hugsanlegar frumugerðir byggt á tjáningu merkjagena og sýndir með t-SNE. Frumueyðandi T-frumur eru skilgreindar með tjáningu CD8A og GZMA, að undanskildum undirklasum með litla tjáningu ríbósómpróteina. Við fengum aðgang að birtum gögnum frá Izar o.fl. (16), þar á meðal innfellingu þeirra á t-SNE, sem getur stjórnað skörun tjáningar milli ónæmisfrumumerkja og NNMT tjáningar.
PBMC voru aðskilin frá hvítfrumnaaðskilnaðarafurðum (STEMCELL Technologies) með Ficoll þéttleikastigulsskilvindu. CD3+ frumur voru einangraðar úr PBMC með CD3 perlum (Miltenyi). Hvort sem MNA var til staðar eða ekki voru CD3+ frumur virkjaðar með plötubundnu CD3 (5μg/ml), leysanlegu CD28 (3μg/ml) og IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Á síðasta degi vaxtar voru lífvænleiki (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) og fjölgun (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) metin með flæðifrumusjá. Metið virkni áhrifafrumna með því að örva frumur með PMA (20 ng/ml) og jónómýcíni (1μg/ml) með GolgiStop í 4 klukkustundir og fylgist með CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) og TNFα-flúoreseín ísóþíósýanati (FITC) (MAb11, BD). Örvið qPCR og ChIP frumur með PMA (20 ng/ml) og jónómýcíni (1μg/ml) í 4 klukkustundir. ELISA ofanfljótandi vökvanum var safnað fyrir og eftir örvun með PMA (20 ng/ml) og jónómýcíni (1 μg/ml) í 4 klukkustundir.
Fylgið leiðbeiningum framleiðanda til að einangra RNA með RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Notið QIAshredder (QIAGEN) til að gera sýnið einsleitt. Notið háafkastamikið RNA til cDNA búnað (Thermo Fisher Scientific) til að mynda viðbótar DNA (cDNA). Notið TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) til að magngreina genatjáningu (samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda) með eftirfarandi könnum: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [glýseraldehýð-3-fosfat af vetni (GAPDH)] og Hs01010726_m1 (SLC22A2). Sýnin voru keyrð á StepOnePlus rauntíma PCR kerfinu (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) í MicroAmp hraðvirkri sjónrænni 96-holu viðbragðsplötu (Applied Biosystems) með MicroAmp ljósfræðilegri filmu. Sérhvert Ct gildi sem fer yfir 35 er talið vera yfir greiningarþröskuldinum og er merkt sem ógreinanlegt.
Framkvæmið ChIP eins og áður hefur verið lýst (58). Í stuttu máli voru frumurnar meðhöndlaðar með formaldehýði (lokaþéttni 1,42%) og ræktaðar við stofuhita í 10 mínútur. Notið viðbættan bólgulausn (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl og 0,1% NP-40) á ís í 10 mínútur, síðan enduruppleyst í ónæmisútfellingarlausn eins og lýst er (58). Sýnið var síðan hljóðbeitt með eftirfarandi lotum: 10 lotur (20 1 sekúndu púlsar) og kyrrstöðutími 40 sekúndur. Ræktið ChIP-gráðu ónæmisglóbúlín G (Cell Signaling Technology; 1μl), histón H3 (Cell Signaling Technology; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) og SP1 (Cell Signaling Technology; 3μl) mótefni með sýninu við 4°C og hristið yfir nótt. Ræktið prótein A perlur (Thermo Fisher Scientific) með sýninu við 4°C og hristið varlega í 1 klukkustund, notið síðan chelex perlur (Bio-Rad) til að auðga DNA-ið og notið próteinasa K (Thermo Fisher) til próteinmeltingar. TNFα hvati var greindur með PCR: áfram, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; hins vegar, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207 bp vara). Myndirnar voru teknar af Image Lab (Bio-Rad) og magngreindar með ImageJ hugbúnaði.
Frumuræktarofninn var safnað eins og lýst er hér að ofan. Ákvörðunin var framkvæmd samkvæmt verklagsreglum framleiðanda fyrir ELISA-sett fyrir TNFα hjá mönnum (Invitrogen), IL-2 hjá mönnum (Invitrogen) og IFN-γ ELISA-sett hjá mönnum (Abcam). Samkvæmt verklagsreglum framleiðanda var ofninn þynntur 1:100 til að greina TNFα og IL-2 og 1:3 til að greina IFN-γ. Notið EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) til að mæla gleypni við 450 nm.
PBMC voru aðskilin frá hvítfrumnaaðskilnaðarafurðum (STEMCELL Technologies) með Ficoll þéttleikastigulsskiljun. CD3+ frumur voru einangraðar úr PBMC með CD3 perlum (Miltenyi). Hvort sem MNA var til staðar eða ekki voru CD3+ frumur virkjaðar með plötubundnu CD3 (5μg/ml), leysanlegu CD28 (3μg/ml) og IL-2 (300 U/ml; Proleukin) í 3 daga. Eftir 3 daga voru frumurnar safnaðar og þvegnar með 0,9% saltvatni og pelletinn frystur. Frumutalning var framkvæmd með flæðifrumusjá (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R stillingu) með 123count eBeads.
Útdráttarefni eins og lýst er hér að ofan. Þurrkaði útdrátturinn var endurbyggður í styrk 4000 frumujafngilda/μl. Greinið sýnið með öfugum fasa litskiljun (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) og CORTECS T3 dálki (2,1 × 150 mm, agnastærð 1,6 μm, porastærð 120 Å; #186008500, Waters). Pólmassagreinir (6470, Agilent), þar sem rafúðajónun virkar í jákvæðu ham. Ferðafasi A er 0,1% maurasýra (í H2O), ferðafasi B er 90% asetónítríl, 0,1% maurasýra. LC-hallinn er 0 til 2 mínútur fyrir 100% A, 2 til 7,1 mínúta fyrir 99% B og 7,1 til 8 mínútur fyrir 99% B. Jafnvægið síðan dálkinn aftur með ferðafasa A við rennslishraða 0,6 ml/mínútu í 3 mínútur. Rennslishraðinn er 0,4 ml/mínútu og dálkhólfið er hitað í 50°C. Notið hreinefnastaðal MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Kanada) til að ákvarða geymslutíma (RT) og umbreytingu (RT = 0,882 mínútur, umbreyting 1 = 137→94,1, umbreyting 2 = 137→92, umbreyting 3 = 137→78). Þegar allar þrjár umbreytingarnar eiga sér stað á réttum geymslutíma er umbreyting 1 notuð til magngreiningar til að tryggja sértækni. Staðalkúrfan fyrir MNA (Toronto Research Chemical Company) var búin til með sex raðþynningum af stofnlausninni (1 mg/ml) til að fá staðla með 0,1, 1,0, 10 og 100 ng/ml og 1,0 og 10μg/ml vökva, talið í sömu röð. Greiningarmörkin eru 1 ng/ml og línulega svörunin er á milli 10 ng/ml og 10μg/ml. Hver inndæling með tveimur míkrólítrum af sýni og staðli er notuð fyrir LC/MS greiningu og blandað gæðaeftirlitssýni er keyrt á átta inndælingar fresti til að tryggja stöðugleika greiningarpallsins. MNA svörun allra MNA-meðhöndluðu frumusýnanna var innan línulegs bils prófunarinnar. Gagnagreiningin var gerð með MassHunter magngreiningarhugbúnaði (útg. 9.0, Agilent).
Önnur kynslóð αFR-CAR smygildisins var tekið úr Song o.fl. (59). Í stuttu máli inniheldur smygildið eftirfarandi efni: leiðaröð CD8a, breytilegt einkeðjubrot sértækt αFR hjá mönnum, hjöru- og himnusvæði CD8a, innanfrumulén CD27 og innanfrumulén CD3z. Öll CAR röðin var mynduð með GenScript og síðan klónuð í annarrar kynslóðar lentiveirutjáningarvektor fyrir ofan GFP tjáningarkassettuna sem notuð var til að meta skilvirkni umbreytingarinnar.
Lentiveiran er framleidd með erfðabreytingu á HEK293T frumum [American Type Culture Collection (ATCC); ræktuð í Dulbecco's modified Eagle miðli sem inniheldur 10% fósturkúasermi (FBS) og 1% PenStrep, og með CAR-GFP vektor og pökkunarplasmíðin (psPAX2 og pMD2.G, Addgene) nota lipofection amine (Sigma-Aldrich). Veiruinnihaldandi ofanvökvinn var safnað 48 og 72 klukkustundum eftir erfðabreytingu, síað og þykkt með örskiljun. Geymið þykka veiruyfirvökvann við -80°C þar til erfðabreyting átti sér stað.
PBMC eru aðskildar frá aðskilnaðarafurðum hvítfrumna úr heilbrigðum gjafa (STEMCELL Technologies) með Ficoll-þéttleikaskiljun. Notið jákvæða val CD8 örperlur (Miltenyi) til að einangra CD8+ frumur frá PBMC. Örvið T-frumur með TransAct (Miltenyi) og í TexMACS miðli [Miltenyi; bætt við 3% hitaóvirkjuðu mannasermi, 1% PenStrep og IL-2 (300 U/ml)]. Tuttugu og fjórum klukkustundum eftir örvun voru T-frumur erfðabreyttar með lentiveiru (10 μl af þéttri veiruyfirborðsvökva á hverjar 106 frumur). 1 til 3 dögum eftir erfðabreytingar á Cytek Aurora (á FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), metið GFP tjáningu frumnanna til að sýna fram á að umritunarhagkvæmni sé að minnsta kosti 30%.
CAR-T frumur voru ræktaðar í 24 klukkustundir í Immunocult (STEMCELL Technologies; bætt við 1% PenStrep) við eftirfarandi skilyrði: ómeðhöndlaðar, meðhöndlaðar með 250 μM adenosíni eða 10 mM MNA. Eftir formeðferð voru CAR-T frumur þvegnar með PBS og sameinaðar 20.000 SK-OV-3 frumum [ATCC; í McCoy 5A miðli (Sigma-Aldrich) bætt við 10% FBS og 1% PenStrep við 10: Hlutfall áhrifavalda og marks, 1, var magnað í þríriti í bættum Immunocult miðli. SK-OV-3 frumur og SK-OV-3 frumur sem höfðu verið leystar upp með digitalis saponíni (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) voru notaðar sem neikvæð og jákvæð samanburðarlausn, talið í sömu röð. Eftir 24 klukkustunda samræktun var ofanvökvinn safnað og laktat dehýdrógenasi (LDH) mælt samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). LDH ofanfljótandi vökvinn var þynntur 1:50 í LDH stuðpúða. Drápshlutfallið var mælt með eftirfarandi formúlu: drápshlutfall = leiðréttingarhlutfall / hámarksdrápshlutfall x 100%, þar sem leiðréttingarhlutfall = samræktun - aðeins T-frumur, og hámarksdrápshlutfall = jákvæður samanburður - neikvæður samanburður.
Eins og lýst er í textanum eða efni og aðferðum skal nota GraphPad Prism 8, Microsoft Excel eða R v3.6.0 fyrir tölfræðilega greiningu. Ef mörg sýni eru tekin frá sama sjúklingi (eins og kviðarholsvökvi og æxli), notum við parað t-próf ​​eða tökum sjúklinginn með sem handahófskenndan áhrif í línulegu eða alhæfðu líkani eftir því sem við á. Fyrir efnaskiptagreiningu er mikilvægisprófið framkvæmt í þríriti.
Sjá nánari upplýsingar um þessa grein á http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Þessi grein er aðgengileg öllum samkvæmt skilmálum Creative Commons Attribution-Non-Commercial leyfisins, sem leyfir notkun, dreifingu og fjölföldun í hvaða miðli sem er, svo framarlega sem endanleg notkun er ekki í viðskiptalegum tilgangi og forsenda þess er að upprunalega verkið sé rétt. Heimild.
Athugið: Við biðjum þig aðeins um að gefa upp netfangið þitt svo að sá sem þú mælir með á síðunni viti að þú vilt að viðkomandi sjái tölvupóstinn og að hann sé ekki ruslpóstur. Við munum ekki safna neinum netföngum.
Þessi spurning er notuð til að kanna hvort þú sért gestur og koma í veg fyrir sjálfvirka ruslpóstsendingu.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralphini J.), Russeller Jones (DeBussell) Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA stuðlar að ónæmisbælingu T-frumna og er mögulegt markmið ónæmismeðferðar við krabbameini hjá mönnum.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralphini J.), Russeller Jones (DeBussell) Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA stuðlar að ónæmisbælingu T-frumna og er mögulegt markmið ónæmismeðferðar við krabbameini hjá mönnum.
©2021 American Association for the Advancement of Science. allur réttur áskilinn. AAAS er samstarfsaðili HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef og COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.